Добір клонів рекомбінантних ДНК

ВИДІЛЕННЯ АМПЛІФІКОВАНИХ РЕКОМБІНАНТНИХ МОЛЕКУЛ ДНК

Якщо рекомбінантна ДНК запакована у фагові частинки, то її легко виділити після клонування шляхом збирання фагового лізату та ізоляції ДНК фагів. Якщо рекомбінантна ДНК присутня у цитоплазмі бактерій у вигляді плазмід, бактерії, по-перше механічно або хімічно руйнують. Потім рекомбінантну плазміду відділяють від більш довгої хромосоми бактерій шляхом центрифугування, електрофорезу або іншими селективними методами.

Індивідуальний клон рекомбінантної ДНК представляє лише невелику частку геному донорного організму або тільки одну із тисяч мРНК, які синтезує донорний організм. Зазвичай, започатковують колекцію усіх сегментів ДНК геному, які можливо отримати за дії ферментів рестрикції. Зокрема, всю геномну ДНК розділяють на сегменти, розміри яких визначаються конкретним вектором для клонування, і вставляють кожний у різні копії вектора, створюючи тим самим колекцію рекомбінантних молекул ДНК. Взяті усі разом вони представляють цілий геном. Потім ці молекули шляхом трансформації або трансдукції вводять в окремі реципієнтні клітини бактерій, де вони ампліфікуються. Така колекція клітин бактерій або бактеріофагів, які несуть рекомбінантні ДНК, називається геномною бібліотекою. Якщо використовується вектор для клонування, який акцептує вставку у середньому 10 тис.п.н. і якщо весь досліджуваний геном має довжину 100000 тис.п.н., що відповідає розміру генома нематоди Caenorhabditis elegans, весь геном буде представлений 100000 тис.п.н.: 10 тис.п.н. = 10000 окремих рекомбінантних клонів ДНК. Для впевненості у тому, що всі нуклеотидні послідовності геному представлені у колекції, геномні бібліотеки створюють таким чином, щоб кожний сегмент геному був повторений до 5 разів. Тотальне клонування всіх виділених фрагментів ДНК також називається шот-ган (shot-gun) – експериментом.

Подібну колекцію можна сформувати із кДНК вставок і називатися така колекція буде кДНК-бібліотекою. Ця бібліотека буде представляти не весь геном, а лише райони геному, що кодують білки. Для побудови вичерпної кДНК-бібліотеки використовують зразки мРНК з різних тканин, різних стадій розвитку та організмів, які сформувалися у різних умовах навколишнього середовища.

Вибір того, чи проводимо ми конструювання геномної бібліотекичи кДНК-бібліотеки залежить від типу донорної ДНК. Якщо ми шукаємо специфічний ген, який є активним у специфічному типі тканини рослини або тварини, треба звернутися до конструювання кДНК-бібліотеки зі зразка цієї тканини. Наприклад, найбільш придатним джерелом для ідентифікації кДНК, які відповідають інсуліновим мРНК людини, і створення відповідної кДНК-бібліотеки будуть численні мРНК з панкреатичних клітин. Оскільки кДНК-бібліотека представляє піднабір транскрибованих ділянок геному, вона буде коротшою, ніж повна геномна бібліотека. Переваги геномних бібліотек полягають у тому, що вони містять гени у їх первісному вигляді, з інтронами та регуляторними послідовностями, що не транскрибуються.

У випадку конструювання рекомбінантної ДНК, яка вміщує визначений ген з деякими відомими характеристиками, фрагменти ДНК, які одержують під дією рестриктаз, розділяють за допомогою електрофорезу у агарозному або поліакріламідному гелі. Бібліотеки генів вміщують значну кількість фрагментів, серед яких є і конкретний ген, який цікавить дослідника. Наступною задачею е ідентифікація конкретного клону у бібліотеці, який несе бажаний ген.

Знаходження конкретного клону у бібліотеці проводять з використанням зондів. Зонд – це невелика ділянка ДНК або РНК (см словарь), завдяки комплементарному зв’язуванню якої з цікавлячим нас геном можливо ідентифікувати необхідний клон.

Зондування ДНК передбачає зв’язування у розчині через повну або часткову комплементарність шляхом випадкового зіткнення двох однониткових фрагментів нуклеїнових кислот (гена пошуку і зонду). Ген пошуку і зонд утворюють стабільний гібрид, що і надає можливість вилучити конкретний ген із великої колекції рекомбінантних фрагментів ДНК. Для проведення цієї операції всі молекули ДНК бібліотеки повинні бути переведені в однонитковий стан шляхом нагрівання. Однонитковий зонд, мічений радіоактивно або хімічно, вводиться у розчин з однонитковими фрагментами ДНК-бібліотеки для пошуку в ній комплементарного фрагменту. Найчастіше розмір зондів 15-20 пар нуклеотидів. Вони гібридизуються зі специфічними комплементарними послідовностями в межах більш крупних клонованих ДНК-фрагментів. Іншими словами, зонди виступають «наживками» для ідентифікації більш великої здобичі.

Процедура зондування специфічного гена в бібліотеці полягає в наступному.

1. Колонії або бляшки бібліотеки з чашки Петрі переносяться на абсорбуючу нітроцелюлозну мембрану шляхом розташування мембрани на поверхні середовища. Колонії або бляшки чіпляються за поверхню і лізуються in situ, далі ДНК денатурується.

2. Мембрана омивається розчином однониткового зонду, специфічного до фрагмента ДНК, який шукають.

Зонд сам є клонованим шматочком ДНК, який має послідовність, гомологічну бажаному гену. Зонд повинен бути міченим або радіоактивним ізотопом, або флуоресцентним барвником. Таким чином, розташування необхідного клону з’ясовується за розташуванням мітки. При використанні радіоактивних міток мембрана вміщується на шматочок рентгенівської плівки і засвічується у місці, відповідному до локалізації радіоізотопу. Засвічена таким чином плівка називається авторадіограмою. Якщо для мічення зонду використовується флуоресцентне забарвлення, мембрана освітлюється світлом визначеної довжини хвилі. Після активування флуоресценції і фотографування у відповідному місці на знімку локалізується забарвлений фрагмент ДНК. Цей фрагмент видаляють, екстрагуючи його з відповідної зони геля, яку попередньо механічно вирізають.

Дата добавления: 2014-01-05