Визначення загального азоту в сечі за методом Кьєльдаля

За методом Мюллера та Зейферта.

Визначення вмісту сечової кислоти в біологічних рідинах

Завдання 1. Визначити вміст сечової кислоти в сироватці крові.

Принцип. Метод базується на здатності сечової кислоти відновлювати фосфатно-вольфраматний реактив (реактив Фоліна) з утворенням сполук, інтенсивність забарвлення яких пропорційна концентрації цієї кислоти.

Хід роботи. У центрифужну пробірку вносять по 1,5 мл сироватки крові, води і 20% розчину трихлороцтової кислоти. Перемішують, через 5 хв центрифугують 10 хв при швидкості 3000 об/хв. Беруть дві чисті градуйовані пробірки (дослідну і стандартну), додають у них реактиви відповідно до схеми:

	Дослід	Стандарт
Центрифугат, що відповідає 0,5 мл сироватки	1,5 мл	-
Стандартний розчин сечової кислоти, 0,2 мг/мл	-	0,5 мл
20% Трихлороцтова кислота	-	0,5 мл
Дистильована вода	-	0,5 мл
Насичений розчин натрію карбонату	0,7 мл	0,7 мл
Реактив Фоліна (обережно!)	1 крапля	1 крапля

Через 10 хв обидві проби фотометрують проти води на ФЕК при довжині хвилі 510-560 нм (зелений світлофільтр) у 5 мм кюветі. Вміст сечової кислоти (Х) у ммоль/л в сироватці крові розраховують за формулою:

Х = (Едосл.×0,01×200)/(Ест.×168), де Едосл. – екстинкція дослідної проби; Ест. – екстинкція стандартної проби; 0,01 – маса сечової кислоти в пробі стандартного розчину, взятого для реакції (мг); 200 – коефіцієнт перерахування на 1 л сироватки крові; 168 – молекулярна маса сечової кислоти.

Завдання 2. Визначити вміст сечової кислоти в сечі.

Принцип. Метод базується на здатності сечової кислоти відновлювати фосфатно-вольфраматний реактив (реактив Фоліна) у фосфатно-вольфра-мову синь, інтенсивність забарвлення якої пропорційна концентрації сечової кислоти. Кількість фосфатно-вольфрамової сині визначають титруванням розчином калію гексаціаноферату (III). Останній окислює фосфатно-вольфрамову синь, і синє забарвлення зникає.

Хід роботи. До 1,5 мл сечі додають 1 мл 20% розчину натрію карбонату і 1 мл реактиву Фоліна, перемішують і титрують розчином 0,01 моль/л калію гексаціаноферату (III) до зникнення синього забарвлення. Для розрахування вмісту сечової кислоти в сечі необхідно знати, яка її кількість відповідає 1 мл розчину 0,01 моль/л калію гексаціаноферату (III). Так, якщо на титрування 1,5 мл стандартного розчину сечової кислоти, що містить 0,75 мг цієї кислоти, після додавання 1 мл 20% розчину натрію карбонату і 1 мл реактиву Фоліна витрачено 0,81 мл калію гексаціаноферату (III), тоді його 1 мл відповідає: 0,75/0,81=0,8 г сечової кислоти. Вміст сечової кислоти (У) у мг/добу в сечі розраховують за формулою: У = (0,8×а×в)/1,5, де 0,8 г сечової кислоти відповідає 1 мл калію гексаціаноферату (III); а – кількість калію гексаціаноферату (III), що витрачена на титрування (мл); в – добовий діурез; 1,5 – кількість сечі, взятої для визначення (мл). Коефіцієнт перерахунку в одиниці СІ (ммоль/доба) дорівнює 0,0059.

Клініко-діагностичне значення. Сечова кислота є кінцевим продуктом обміну пуринових нуклеотидів. У нормі концентрація сечової кислоти в сироватці крові становить 0,10-0,40 ммоль/л, а з сечею виділяється 2,36-5,90 ммоль/добу. Підвищений вміст сечової кислоти в крові (гіперурікемія) має місце при багатьох патологічних станах, пов’язаних з посиленим розпадом нуклеопротеїнів (лейкоз, діабет, алергія), при дефектах ферментів фосфорибозилдифосфатсинтетази та гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (подагра, синдром Леша-Ніхана), аденінфосфорибозилтрансферази (сечокам’яна хвороба), а также при хворобі Гірке (недостатність глюкозо-6-фосфатази у печінці). Збільшення концентрації сечової кислоти є головним діагностичним критерієм подагри. Очевидно, що при зміщенні реакції середовища в кислу сторону сечова кислота відкладається в тканинах, хрящах, суглобових сумках. Гіпоурікемія та підвищена екскреція гіпоксантину і ксантину можуть бути наслідком недостатності ксантиноксидази, викликаної порушеннями в структурі гену цього фермента, або результатом пошкодження печінки. Гіпоурікурія спостерігається при подагрі, нефриті, нирковій недостатності; гіперурікурія може спостерігатися при підвищеному надходженні та посиленому розпаді нуклеопротеїнів. У дітей виділяється відносно більше сечової кислоти, ніж у дорослих.

Завдання 3. Визначити загальний азот сечі за методом Кьєльдаля.

Принцип. Сечу спалюють (мінералізують) у концентрованій сульфатній кислоті. При цьому азот усіх органічних і неорганічних сполук у вигляді амоніаку зв’язується із сульфатною кислотою, переходить в амоній сульфат, який, реагуючи з реактивом Несслера, утворює сполуку жовто-оранже-вого кольору. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації азоту.

Хід роботи. 1. Мінералізація. У пробірку вливають 0,5 мл сечі, додають 0,05 мл конц. сульфатної кислоти. Спалювання здійснюють на піщаній бані: пробірка повинна торкатися тільки верхнього шару піску. Спочатку випаровується вода, сеча набуває бурого забарвлення. Пробірку знімають з бані, дають їй охолонути, додають 2 краплі пергідролю і знов ставлять для спалювання до знебарвлення рідини. Слід перевірити колір рідини у пробірці після її охолодження, оскільки часто рідина, яка здається безбарвною у гарячому стані, при охолодженні темнішає. Після охолодження в пробірку додають 10 мл свіжокип’яченої дистильованої води, нейтралізують 12,5М їдким натром до слабо лужної реакції, яку визначають за зміною кольору лакмусового папірця з червоного на синій. Надлишок основи у разі нейтралізації призводить до помутніння розчину. Недостатність основи спричиняє випадіння солей ртуті з реактиву Несслера, і дослід вважають зіпсованим.

2. Кольорова реакція (несслеризація). У пробірку додають 0,5 мл реактиву Несслера (калій-меркурію йодид), унаслідок чого вміст пробірки забарвлюється у жовтий колір різної інтенсивності залежно від вмісту азоту.

Паралельно з дослідною пробою обробляють стандартну пробу: 0,2 мл стандартного розчину амонію сульфату; 0,05 мл конц. сульфатної кислоти; 0,3 мл 12,5 М розчину їдкого натру; 0,5 мл реактиву Несслера і 9,8 мл дистильованої води. Дослідну і стандартну проби вимірюють порівняно з контролем на реактиви за довжини хвилі 440-450 нм у 5 мм кюветі. Контроль роблять як стандартну пробу, але замість стандартного розчину амонію сульфату додають воду. Контрольна проба повинна мати легкий жовтуватий відтінок. Більш насичений колір контролю свідчить про наявність у дистильованій воді азоту (амоніаку). Розрахунок здійснюють за формулою: Сд=Сст.×(Ед./Ест.), де Сд – концентрація загального азоту в сечі (ммоль/л); Ед. – екстинкція дослідної проби; Сст. – концентрація загального азоту в стандарті; Ест. – екстинкція стандартної проби.

Клініко-діагностичне значення. За добу людина виділяє 10-17 г азоту, з якого 80-90% припадає на сечовину. За цим показником визначають нітрогеновий баланс організму, а також функціональний стан печінки, нирок та інших органів.

ЛІТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія / Ю. І. Губський. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 270- 283.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія: підручник / Ю. І. Губський. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 329-343.

3. Біохімія людини: підручник / Я.І. Гонський, Т.П Максимчук., М.І Калинський. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 435-462.

4. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т Березов, Б.Ф.Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 451-456, 459-468.

5 Біологічна хімія / Л.М. Вороніна. та ін. – Харків: Основа, 2000. – С. 351-355.

6. Биохимия: учебник / под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 521-544.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия / А.Я. Николаев. – М.: ООО Мед. информ.аг-во, 1998. – С. 339-350.

8. Практикум з біологічної хімії / Д.П. Бойків, О.Л. Іванків, Л.І. Коби-лянська та ін.; за ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С.180-189.

9. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 212-219.

ЗМІСТОВИЙ МОДУЛЬ 16

ЗАНЯТТЯ 8 (2 години)

Тема: Біосинтез нуклеїнових кислот та білків (матричні біосин-тези). Переніс генетичної інформації. Основи молекулярної генетики.

Актуальність. Одним з головних досягнень сучасної біохімії та її новітніх розділів є розшифровка механізмів біосинтезу нуклеїнових кислот та білка. АМК розташовуються в поліпептидному ланцюгу не хаотично, а в точно визначеній послідовності, яка забезпечує унікальність структури і функцій. Механізм біосинтезу білків повинен мати точну координуючу систему, яка автоматично програмує включення кожного амінокислотного залишку у визначене місце поліпептидного ланцюга. Координуюча система визначає первинну структуру, а вторинна і третинна структури білкової молекули визначаються первинною, її фізико-хімічними властивостями і хімічною будовою. Функції збереження, реалізації та передачі спадкової інформації виконують нуклеїнові кислоти (ДНК, РНК). ДНК виконує функцію но-сія генетичної інформації, передача якої проходить за допомогою більш лабільних, ніж ДНК, структур – РНК. Єдиними речовинами, в яких реалізується генетична інформація, є білкові макромолекули. Процес переносу генетичної інформації визначає розвиток, життєдіяльність організму. Спеціалізація функцій клітин (печінки, мозку, м’язів тощо) залежить від набору білків і, в першу чергу, ферментів, що контролюють обмінні процеси на клітинному рівні.

Мета. Детально вивчити матричні біосинтези з метою використання отриманих знань для розуміння механізмів регуляції активності генів у прокаріотів та еукаріотів, дії інгібіторів матричних біосинтезів – лікарських препаратів і бактеріальних токсинів, молекулярних механізмів генетичної мінливості, молекулярної патології біосинтезу білків, принципів лікування і профілактики молекулярних захворювань, використання рекомбінантних ДНК та клонування генів в медицині.

ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ

ПІД ЧАС ПІДГОТОВКИ ДО ЗАНЯТТЯ

ТЕОРЕТИЧНІ ПИТАННЯ

1. Реплікація ДНК; біологічне значення; полуконсервативний механізм реплікації. Відкриття Дж. Уотсона і Фр. Кріка.

2. Загальна схема біосинтезу ланцюгів ДНК. Ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів: схема реплікації ДНК.

3. Молекулярні механізми реплікації ДНК, значення антипаралельності ланцюгів ДНК, фрагменти Оказакі. Етапи синтезу дочерніх ланцюгів молекул ДНК.

4. Загальна схема транскрипції РНК. РНК-полімерази прокаріотів та еукаріотів.

5. Етапи і ферменти синтезу РНК. Сигнали транскрипції: промоторні, ініціюючі, термінаторні ділянки геному.

6. Процесінг – посттранскрипційна модифікація РНК. Антибіотики – інгібітори транскрипції.

7. Генетичний (біологічний) код, триплетна структура, властивості.

8. Рибосомальна білоксинтезуюча система, її компоненти. Структура рибосом еукаріотів.

9. Транспортні РНК і активація амінокислот. Аміноацил-тРНК-синтази.

10. Етапи і механізми трансляції: ініціація, елонгація, термінація. Ініціюючі та термінуючі кодони мРНК.

11. Посттрансляційна модифікація пептидних ланцюгів. Регуляція трансляції. Молекулярні механізми контролю трансляції на прикладі біосинтезу глобіну.

12. Вплив фізіологічно активних речовин на процеси трансляції. Антибіотики – інгібітори трансляції у прокаріотів та еукаріотів, їх використання в медицині.

13. Регуляція експресії генів прокаріотів. Схема за Ф.Жакобом і Ж.Моно: структурні та контрольні гени: промотор, регуляторний ген.

14. Особливості молекулярної організації ДНК та експресія геному еукаріотів (екзони, інтрони; послідовності, які повторюються).

15. Генетичні рекомбінації у прокаріотів (трансформація, трансдукція, кон’югація).

16. Біологічне значення і механізми репарації ДНК. Репарація УФ-індукованих генних мутацій; пігментна ксеродерма.

17. Генна інженерія або технологія рекомбінантних ДНК: загальні поняття, біомедичне значення.

18. Технологія трансплантації генів і отримання гібридних молекул ДНК. Клонування генів з метою отримання біотехнологічних лікарських речовин (гормонів, ферментів, антибіотиків, інтерферонів тощо).

19. Мутації: геномні, хромосомні, генні. Роль у виникненні ензимопатій та спадкових хвороб людини.

ТЕСТОВІ ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ

1. Назвіть мінорну сполуку, яка приймає участь в утворенні «кепу» в мРНК.

А. 7-Метилгуанозин.	D. 7-Метиладенозин.
В. 1-Метиладенозин. С. 5-Оротоурідин.	Е. Метилцитозин

2. До біологічних функцій ДНК відноситься:

А. Зберігання спадкової інформації.	D. Зберігання і передача інформації.
В. Передача генетичної інформації нащадкам. С. Реалізація генетичної інформації.	Е. Все перераховане.

3. Синтез праймера – фрагменту РНК – відбувається на стадії:

А. Ініціації. В. Елонгації. С. Термінації. D. Реплікації. Е. Трансляції.

4.Амінокислота в ході синтезу аміно-ацил-тРНК приєднується до:

А. Антикодону.	С.3`-Кінця тРНК.	Е. 3`-Кінця мРНК.
В. Кодону.	D. 5`-Кінця тРНК.

5.Антибіотик рифампіцин, який використовують для лікування туберкульозу, впливає на деякі біохімічні процеси. Назвіть їх.

А. Інгібує ДНК-полімеразу на стадії ініціації.

В. Інгібує РНК-полімеразу на стадії ініціації.

С. Інгібує ДНК-лігазу.

D. Інгібує аміноацил-тРНК-синтетазу.

Е. Інгібує дію білкових факторів в синтезі білка.

6. У хворих пігментною ксеродермою шкіра дуже чутлива до сонячного світла, може розвитися рак шкіри. Причина – спадкова недостатність ферменту УФ-ендонуклеази. Внаслідок якого дефекту порушується процес?

А. Реплікації ДНК.	С. Репарації ДНК.	Е. Зворотної транскрипції.
В. Транскрипції.	D. Трансляції.

7. У клінічній практиці знайшли широкого використання антибіотики - інгібітори синтезу нуклеїнових кислот і білків. Яку реакцію або процес гальмує тетрациклін?

А. Елонгацію поліпептидного ланцюга в прокаріотів та еукаріотів.

В. Ініціацію трансляції в прокаріотів.

С. Зв’язування аміноацил-тРНК в А-центрі рибосом прокаріотів.

D. Ініціацію транскрипції в прокаріотів.

Е. Пептидилтрансферазну реакцію процесу трансляції в прокаріотів.

8. Віддалення з ланцюга ДНК зміненої азотної основи досягається узгодженою дією всіх перерахованих нижче ферментів, крім:

А. РНК-залежної-ДНК-полімерази.	D. Ендонуклеази.
В. ДНК-полімерази. С. ДНК-глікозидази.	Е. ДНК-лігази.

9. Хворому з бешихистим запаленням лікар призначил еритроміцин, який зв’язується з 50S-субодиницею рибосом і блокує транслоказу. Інгібування синтезу білка в прокаріотів еритроміцином відбувається на стадії:

А. Термінації. В. Активації амінокислот.	D. Посттрансляційній модифікації білків. Е. Ініціації.
С. Елонгації.

10. Робітниця хімічного підприємства внаслідок порушення правил безпеки роботи піддалася дії азотистої кислоти та нітритів, які викликають дезамінування цитозину в молекулі ДНК. Який фермент запускає ланцюг репараційних процесів?

А. ЦТФ-синтетаза. В. ДНК-залежна-РНК-полімераза.	D. Аміноацил-тРНК-синтетаза. Е. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа.
С. Урацил-ДНК-глікозидаза.

11. У юнака, 20 років, за допомогою полімеразної реакції поставлений діагноз ВІЛ-інфекція. Укажіть, що є основним в цій реакції.

А. Генетична рекомбінація. В. Ампліфікація генів.	D. Генна мутація. Е. Хромосомна мутація.
С. Транскрипція.

12. Для уточнення діагнозу лікар рекомендував хворому ДНК-діагностику. Відомо, що при цьому використовують синтетичні праймери, до складу яких входять:

А. Дезоксирибонуклеотиди. В. Рибонуклеотиди.	D. Піримідинові нуклеотиди. Е. Пуринові нуклеотиди.
С. Амінокислоти.

13. Взаємодія тРНК з амінокислотами з утворенням аміноацил-тРНК потребує: А. НАД. В. ФАД. С. АТФ. D. АМФ. Е. Вітамін В₁.

14. Ділянки ДНК, які несуть інформацію про структуру білка, називають:

А. Інтрони. В. Екзони. С. Гістони. D. Оперони. Е. Кодони.

15. Аномальний гемоглобін М з’явився в результаті заміни в β-ланцюгу глобіну амінокислоти валіну на глутамат в 6 положенні. Якого типу мутація в ДНК?

А. Місенс-мутація. В. Делеція одного нуклеотиду.	D. Делеція трьох нуклеотидів. Е. Вставка трьох нуклеотидів.
С. Вставка одного нуклеотиду.

ЛІТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія / Ю. І. Губський. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 284- 329.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія: підручник / Ю. І. Губський. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 344-393.

3. Біохімія людини: підручник / Я.І. Гонський, Т.П Максимчук., М.І Калинський. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 463-506.

4. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т Березов, Б.Ф.Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 451-456, 459-468.

5 Біологічна хімія / Л.М. Вороніна та ін.. – Харків: Основа, 2000. – С. 356-425.

6. Биохимия: учебник / под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 140-226.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия / А.Я. Николаев. – М.: ООО Мед. информ.аг-во, 1998. – С. 92-159.

ЗАНЯТТЯ 9 (4 години)

Дата добавления: 2015-04-30