Ротационный механизм действия фермента

ИЗМЕНЕНИЯМИ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ АТФ-СИНТАЗЫ.

СИНТЕЗ АТФ СВЯЗАН С КОНФОРМАЦИОННЫМИ

АТФ-синтазы разного происхождения — из митохондрий, хлоропластов или бактериальных мембран — имеют в целом схожее строение, что говорит о, несомненно, древнем эволюционном происхождении фермента. На снимках, полученных при помощи электронной микроскопии, АТФ-синтазы выглядят как локализованные в мембранах грибовидные структуры. Хорошо видно, что фермент состоит из двух частей — двух белковых комплексов, которые обозна­чают как фактор F₁ и фактор F_o (CF₁ и CF₀ — для АТФ-синтазы хлоропластов). Фактор, или комплекс, F₁расположен вне мембраны и на снимках представ­ляет собой «шляпку» гриба высотой 8 нм и шириной 10 нм. Этот гидрофиль­ный сферический комплекс представляет собой каталитический центр, на котором осуществляется синтез АТФ. Гидрофобный F₀-фактор интегрально встроен в мембрану и формирует канал, по которому ионы Н⁺ могут пересе­кать мембрану, двигаясь по градиенту своего потенциала. Более детально струк­тура фермента была исследована с помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением 0,28 нм на комплексах, выделенных из митохондрий сердца быка и мембран Escherichia coli (рис. 2:2).

Рис. 2.2. Модель АТФ-синтазы F ₁ F ₀ -типа.

Периферический F₁-фактор состоит из пяти видов субъединиц (α₃β₃γδε) и несет на (β-субъединицах каталитические центры.

Р₁-фактор заякорен в мембране с помощью γ-субъединицы и F₀-фактора. F₀-комплекс состоит из трех видов субъединиц в соотношении a_lb₂c_l0-_l2. Субъедини­цы а и с формируют протонный канал, через который ионы Н⁺ входят с одной, а выходят с другой стороны мембраны. Движение протонов внутри кольца из с-субъединиц сопровождается его вращением и вращением связанных с ним γε-субъединиц. Ротация сопровождается конформационными изменениями каталитических центров

F₁-комплекса, в которых идет синтез АТФ. По-видимому, α₃β₃-комплекс не вращается, так как удерживается в фиксированном положении с помощью δ- и двух b-субъединиц. В митохондриях F₁ -комплекс обращен в матрикс.

Комплекс F₁ состоит из пяти разных субъединиц в определенном соотноше­нии: α₃β₃γδε. Основу его структуры составляют гомологичные субъединицы α и β, чередующиеся друг с другом. Места связывания для нуклеотидов есть на обеих субъединицах, но три активных центра, где происходит синтез АТФ, расположены в основном на субъединицах β. Субъединицы α и β расположены поочередно вокруг γ-субъединицы, которая представляет собой стержень (≈ 9 нм) и, как втулка, проходит через каталитический центр, связывая факторы F₁ и F_o. Субъединица δ, расположенная на внешней стороне одной из β-субъединиц, служит сайтом прикрепления двух b -субъединиц, которые заякоривают комплекс F₁в мембране. Функции ε-субъединицы связаны с регуляцией: ε-субъединица избирательно препятствует гидролизу АТФ. Фактор F₁ легко диссоци­ирует от F_o и проявляет in vitro АТФазную активность, гидролизуя АТФ.

Комплекс F_o состоит из трех типов белковых субъединиц в следующем со­отношении: a₁b₂с_9-12. Он обеспечивает связывание F₁ с мембраной и перенос протона. Небольшие, очень гидрофобные

с -субъединицы, имеющие по дватрансмембранных участка, формируют проводящий протоны канал, который обеспечивает прохождение Н⁺ через всю мембрану. Интересно отметить, что такой сложный ферментный комплекс, как АТФ-синтаза, находится под двой­ным генетическим контролем: три субъединицы F₀-фактора и α-субъединицы фактора F₁ кодируются геномом митохондрий или хлоропластов, тогда как синтез остальных субъединиц контролируется ядерными генами.

Исследования АТФ-синтазных комплексов велись давно, но механизм их действия и структурно-функциональная связь факторов F₁ и F_o стали понят­ными относительно недавно. Здесь следует отметить приоритет работ Р.Воуеr и J.Walker (Нобелевская премия, 1997). Благодаря исследованиям этих ученых стал понятным принцип работы фермента, получивший название ротационно­го механизма. Согласно ротационному механизму, энергия, освобождаемая при диффузии протонов через F₀-канал, используется для вращения γ-субъединицы. Результатом ротации γ-субъединицы является последовательная смена конформационных состояний активных центров, расположенных на трех

β-субъединицах Р₁-комплекса. Синтез АТФ из АДФ и Ф_н идет в активных центрах спонтанно благодаря конформационным перестройкам. Энергия Δ осво­бождаемая в результате протонного транспорта через F₀-канал, используется не на синтез АТФ, а для освобождения АТФ из активного центра в результате изменения его конформации. Прямое доказательство ротационного механизма было получено японскими учеными, которым удалось продемонстрировать вращение γ-субъединицы относительно сидящего на ней фактора F₁. Изолиро­ванный комплекс F₁ был иммобилизован на неподвижной подложке, а к кон­цу γ-субъединицы был химически пришит флуоресцирующий фрагмент нити актина длиной 1 мкм. С помощью флуоресцентного микроскопа в реальном времени удалось наблюдать вращение нити актина при работе фермента, гидролизующего АТФ.

Часто АТФ-синтазу называют молекулярным мотором и используют механи­ческие термины для описания ее работы. Считается, что комплекс α₃β₃-субъединиц удерживается в фиксированном положении, так как за якорем в мем­бране через субъединицы δ, 2b, а, выполняющие функцию «статора». Ток Н⁺ вызывает вращение кольца, состоящего из субъединиц с и контактирующих с ним субъединиц γ и ε, которые все вместе выполняют функцию вращающего­ся «ротора».

Известно, что субъединица а образует 5 трансмембранных α-спиралей и фор­мирует пути для входа Н⁺ с одной стороны мембраны и выхода — с другой. Движение Н⁺ внутри кольца из субъединиц с связано с последовательным протонированием/депротонированием ключевого остатка аспартата (Asp-61), расположенного на одной из двух α-спиралей с -субъединиц. Этот процесс со­пряжен с поворотом каждой с -субъединицы и запускает пошаговое вращение с-кольца (ротора) относительно ab ₂-статора. Расчеты показывают, что синтез одной молекулы АТФ сопряжен с транспортом 3-4Н⁺ через F₀-канал.

Рассмотрим подробно, в результате каких событий происходит синтез АТФ в каталитическом центре фермента. Согласно последним данным (Р. Воуеr, 2002), в результате вращения γ-субъединицы относительно α₃β₃-комплекса изменяет­ся конформация расположенных на β-субъединицах трех активных центров, каждый из которых в данный момент времени может находиться в трех разных состояниях (рис. 2.3). Эти конформационные состояния, названные «открытым» («open» — О), «закрытым» («tight» — Т) и «слабосвязанным», или «неплотным» («loose» — L), центрами, различаются по степени сродства к АДФ, АТФ и Ф_н. Принципиальным моментом является тот факт, что в результате тесного контакта между α-, β- и γ-субъединицами конформационные измене­ния возникают одновременно на всех трех β-субъединицах при повороте γ-субъединицы на 120°. При этом каждый активный центр последовательно проходит через три смены конформаций и возвращается в исходное состояние при полном повороте γ-субъединицы на 360° (см. рис. 2.3). Каталитический цикл начи­нается со связывания АДФ и Ф_н в О-центре: в «открытом» состоянии центр имеет высокое сродство к АДФ и крайне низкое — к АТФ. В то же время АДФ и Ф_н относительно слабо удерживаются в центре и могут выходить из него. Поворот γ-субъединицы на 120° переводит О-центр в «закрытое» Т-состояние. В Т-центре молекулы АДФ и Ф_н уже прочно связаны и не могут его покинуть. Конформация Т-центра такова, что в нем самопроизвольно идут акты образо­вания и разрыва ковалентной связи АДФ~Ф_Н, т.е. синтеза и гидролиза АТФ.

Рис. 2.3. Состояние каталитических центров АТФ-синтазы:

А — F₁ - комплекс на трех β-субъединицах несет три активных центра, которые одновременно могут находиться в одном из трех конформационных состояний — О-центр, Т-центр и L-центр. Ротация γ-субъединицы в момент движения протонов через F₀-канал вызывает изменение конформации сразу трех центров; Б — конформационные изменения одного активного центра при повороте γ-субъединицы на 360°. Субстраты, АДФ и Ф_н связываются в «открытом» О-центре. Ротация

γ-субъединицы на 120° переводит центр в «закрытое» Т-состояние. В Т-центре спонтан­но идут реакции синтеза и гидролиза АТФ. При следующем шаге вращения на 120° Т-центр переходит в L-центр, из которого возможен выход синтезированной АТФ. Пунктиром указаны возможные промежуточные состояния центров

Важно, что синтез АТФ в «закрытом» центре идет спонтанно, энергетиче­ски даром, только за счет создания особой конфигурации между активными группами фермента и молекулами АДФ и Ф_н. Более того, синтез АТФ в «зак­рытом» центре может идти даже в условиях деэнергизованной мембраны или даже вне мембраны на изолированном F₁- комплексе. Однако освобождения синтезированной АТФ из «закрытого» центра не происходит: для этого необ­ходим следующий этап вращения и переход в состояние L-центра. В этом со­стоянии связи АТФ с центром ослабевают и молекула может его покинуть и перейти в водную фазу. Следует отметить, что в момент открытия Т-центра в нем находится именно молекула АТФ. Предполагается, что в момент перехода равновесие

АДФ + Ф_н ↔ АТФ сдвигается в сторону синтеза АТФ под влиянием протондвижущей силы. Следующий этап вращения переводит центр в исходное, «открытое» состояние, из которого, вероятно, также возможен выход АТФ. В течение синтеза АТФ конформационные состояния активных центров после­довательно меняются в направлении: О → Т →L → О.

Таким образом, согласно ротационному механизму, энергия Δ расходу­ется не на стадии образования химической связи АДФ ~ Ф_н, а необходима для смены конформаций и выхода АТФ из активных центров фермента. При нали­чии Ар для быстрого синтеза АТФ в Т-центре второй каталитический центр в О-конформации должен содержать связанные АДФ и фосфат.

В условиях, неблагоприятных для синтеза АТФ, например при низком со­держании АДФ или Ф_н или при низкой ∆ρ, возможны гидролиз АТФ и пере­качка протонов против градиента. В этом случае происходит связывание АТФ в L-центре и гидролиз АТФ, сопряженный с последовательной сменой конфор­маций в обратном направлении L → Т →О.

В настоящее время интенсивно изучаются все аспекты работы АТФ-синтазы. Аминокислотные остатки и функциональные группы, критичные для враще­ния и для конформационных изменений, исследуются с помощью точечного мутагенеза, позволяющего получать мутации, связанные с заменой в структу­ре фермента одной единственной аминокислоты. В то же время молекулярные механизмы сопряжения двух физически дистанцированных процессов — транс­порта протонов и синтеза АТФ — остаются пока неясными.

Дата добавления: 2015-05-08