Работа 12. Ферментативный гидролиз жира молока

Работа 12. Качественные реакции на ацетон и ацетоуксусную кислоту

К кетоновым телам относятся ацетон, β-оксимасляная кислота и ацетоуксусная кислота. Биосинтез кетоновых тел происходит в печени. У здорового человека в печени ацетоацетил-СоА конденсируется с ацетил-СоА с образованием β-окси-β-метилглутарил-СоА. В крови в норме они содержатся в очень небольшом количестве 13,4-185 мкмоль/л (0,14-1,9 мг%), в моче также содержатся ацетоновые тела в небольшом количестве и не выявляются обычными реакциями.

Повышенное выделение кетоновых тел из организма – ацетонурия наблюдается при нарушении жирового или углеводного обмена. Образование кетоновых тел происходит в печени, откуда они доставляются другим тканям в качестве энергетического материала.

Исследуемый материал: моча, содержащая ацетон и ацетоуксусную кислоту.

Реактивы: нитропруссид натрия, ледяная уксусная кислота, 10%-ная NaОН.

Оборудование: пробирки, пипетки.

ХОД РАБОТЫ. Проба Легаля на ацетон. Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия оранжево-красное окрашивание. После подкисления ледяной уксусной кислотой образуется соединение вишневого цвета.

В пробирку наливают 0,5 мл мочи, 0,5 мл NaOH, 0,5 мл нитропруссида натрия. Появляется оранжево-красное окрашивание. Добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты – появляется вишнево-красное окрашивание.

Клинико-диагностическое значение. Гиперкетонемия и кетонурия наблюдаются при сахарном диабете, приеме кетогенной пищи (дефицит углеводов), голодании, гиперпродукции гормонов-антагонистов инсулина, кортикостероидов. При сахарном диабете. Когда печень бедна гликогеном, происходит усиленный распад жиров как источника энергии. В раннем детском возрасте продолжительные желудочно-кишечные заболевания (дизентерия, токсикозы) могут вызвать кетонемию в результате голода и истощения.

Жиры, или триацилглицерины, практически не всасываются в пищеварительном тракте. В тонкой кишке происходит их гидролиз, который катализируется липолитическими ферментами, вырабатываемыми поджелудочной железой. Существует несколько типов панкреатических липаз. Одни из низ специфичны в отношении эфирных связей в a-положении триацилглицерина, а другие гидролизуют связи в b-положении. Полный гидролиз триацилглицеринов происходит постадийно: сначала гидролизуются a-связи, а затем более медленно гидролизуются b-моноацилглицерины. Конечные продукты переваривания (глицерин, высшие жирные кислоты, моно- и диацилглицерины) всасываются в стенках кишечника.

В процессе переваривания и всасывания липидов важную роль играют желчные кислоты. Они эмульгируют жиры, активируют липазу и обеспечивают всасывание нерастворимых продуктов переваривания.

Исследуемый материал: молоко, разведенное в соотношении 1:10.

Реактивы: спиртовой раствор фенолфталеина; 0,01% раствор NaOH; панкреатин, содержащий липазу.

Оборудование: колбы на 25 мл, мерные цилиндры на 10 мл, пипетки, термостат, кипящая водяная баня, бюретка.

ХОД РАБОТЫ. Готовят 3 колбы для опытных и контрольной проб. Для контрольной пробы липазу (содержащуюся в панкреатине) предварительно кипятят в течение 10 мин на кипящей бане. В каждую колбу наливают молоко и препарат липазы и желчь, как указано в таблице.

Компоненты инкубационной смеси	Опыт 1, мл	Опыт 2, мл	Контроль, мл
Молоко (разведенное в соотношении 1:10)
Препарат липазы			1 (прокипяченная)
Препарат желчи	-		-

Приготовленные инкубационные смеси тщательно перемешивают. Затем из каждой колбы отбирают по 2 мл смеси в заранее приготовленные стаканчики для титрования. В каждый стаканчик добавляют по 2 капли раствора фенолфталеина и титруют раствором NaOH до слабо-розового окрашивания. При первом титровании нейтрализуются органические кислоты – молочная и другие, которые присутствуют в молоке до начала действия липазы.

Оставшуюся в колбах смесь помещают в термостат (температура 38-40°С) и через определенные интервалы (10, 20, 30, 40 мин) из каждой пробы отбирают (не вынимая из термостата) по 2 мл смеси и титруют 0,01 моль/л раствором NaOH. Время титрования и объем гидроксида натрия фиксируют в таблице.

Время инкубации, мин	Объем NaOH, пошедшего на титрование, мл
Опыт 1	Опыт 2	Контроль

Результаты первого титрования, полученного до начала действия липазы, вычитают из результатов последующих титрований.

На основании полученных данных строят график, где по оси абсцисс откладывают время (в минутах), а по оси ординат – активность липазы, выраженную объемом раствора NaOH (в мл), пошедшего на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся за данный отрезок времени.

Делают выводы об условиях работы липазы.

Контрольные вопросы

1. Классификация липидов.

2. Что такое число омыления и как оно определяется?

3. Что такое кислотное число, как оно определяется и что характеризует?

4. Принцип метода определения желчных кислот.

5. Принцип метода определения кетоновых тел.

6. Принцип метода определения витамина Е.

7. Клинико-диагностическое значение определения содержания кетоновых тел в сыворотке крови и моче.

Раздел 3. Белки

Белки представляют собой высокомолекулярные полимерные органические соединения, структурными единицами которых являются аминокислоты. Аминокислоты в молекуле белка соединены между собой пептидными связями (– СО – NH –), образуя полипептидные цепи. Пептидная связь возникает между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой, что сопровождается выделением молекулы воды. В белках различают несколько уровней структурной организации. Первичная структура белка определяется числом и последовательностью аминокислотных остатков, соединенных между собой при помощи пептидной связи. Вторичная структура возникает за счет образования водородных связей между группами - N – H и О = С - данной полипептидной цепи, что приводит к упорядоченному расположению гибкой полипетидной цепи в виде спиральной или складчатой структуры. Третичная структура возникает в результате взаимодействия между боковыми цепями аминокислотных остатков полипептидных цепей. К таким взаимодействиям относятся водородные, дисульфидные и ионные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные силы. В результате таких взаимодействий полипептидная цепь свертывается очень сложным, но вместе с тем определенным образом, приобретая характерную пространственную конфигурацию. Межмолекулярные взаимодействия между отдельными полипептидными цепями, обладающими вторичной и третичной структурой, могут приводить к образованию агрегатов, то есть к возникновению четвертичной структуры белка. Структура белковой молекулы очень лабильна и легко разрушается под влиянием различных физических и химических воздействий, в результате чего изменяются ее биологические и физико-химические свойства.

Дата добавления: 2015-07-02