Ткани иодометрическим методом

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА В МЫШЕЧНОЙ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 12

Ц е л ь р а б о т ы - определить содержание гликогена в мышечной ткани.

Метод основан на осаждении гликогена из гидролизата спиртом, гидролизе гликогена до глюкозы и определении глюкозы иодометрическим методом.

Оборудование, реактивы, материалы:

Центрифуга; баня водяная; ткань мышечная; гидроксид калия (30%-й раствор); спирт; эфир; кислота серная (конц.); кислота соляная (2,2%-й раствор); иодид калия (2,5%-й раствор); гидроксид калия (2%-й раствор); кислота серная (0,1 н раствор); тиосульфат натрия (0,01 н раствор); реагент окислительный.

Приготовление окислительного реагента: 28 г Na₂HPO_4*12H₂O и 40 г сегнетовой соли (KNaC₄H₄O_6*4H₂O) растворить в 500 мл H₂O, добавить 100 мл 1 н раствора NaOH, прилить при помешивании 80 мл 10%-го раствора CuSO_4*5H₂O, добавить 180 г Na₂SO₄.

После растворения Na₂SO₄ жидкость перенести в мерную колбу емкостью 1 л, добавить 50 мл 0,1 н раствора KJO₃, довести объем до метки. Раствор отстаивать сутки, отфильтровать.

Порядок выполнения работы

Навеску мышечной ткани массой 2 г помещают в центрифужную пробирку, ставят в кипящую водяную баню для первоначального гидролиза. Гидролиз продолжают в течение 2,5-3 часов. Пробирку следует периодически встряхивать.

По окончании гидролиза к содержимому пробирки добавляют при перемешивании 10 мл спирта и снова помещают пробирку в водяную баню.

Когда содержимое пробирки начнет кипеть, нагревание прекращают. После охлаждения содержимое пробирки центрифугируют. Осторожно сливают жидкость над осадком.

Осадок гликогена промывают в пробирке 10 мл 90%-го раствора спирта, а затем эфиром. После центрифугирования спирт и эфир осторожно сливают из пробирки.

К осадку гликогена добавляют 6 мл дистиллированной воды, нейтрализовав смесь по лакмусу, и 2-8 капель концентрированной H₂SO₄. Далее в пробирку вносят 20 мл 2,2%-го раствора HCl, прикрывают пробирку пробкой и помещают ее в кипящую водяную баню на 3 ч для гидролиза гликогена с превращением в глюкозу.

По окончании нагревания содержимое пробирки количественно переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную колбу емкостью 250 мл, нейтрализуя по лакмусу сначала несколькими каплями концентрированного раствора KOH, затем 2%-м раствором KOH и добавляют дистиллированную воду до метки. Хорошо перемешивают содержимое колбы, а затем отфильтровывают.

В коническую колбу емкостью 50 мл вносят 5 мл фильтрата и добавляют 5 мл окислительного реагента. Хорошо перемешивают

содержимое пробирки, помещают ее на 15-20 мин в кипящую водяную баню, а затем охлаждают струей воды.

В охлажденную пробирку осторожно, по стенке (без перемешивания), вносят 1 мл 2,5%-го раствора KJ, добавляют 3 мл 1 н раствора H₂SO₄ при энергичном перемешивании смеси встряхиванием пробирки.

Через 3 мин йод отфильтровывают 0,01 н раствора тиосульфата натрия в присутствии крахмала.

Расчетная формула:

Содержание гликогена w (в %) в мышечной ткани вычисляют по формуле:

w = (v – v₁)_*0,25_*v_2*100,

v_3*m_*1000

где v – объем 0,01 н раствора Na₂S₂O₃, израсходованного на титрование в контрольном опыте, мл; v₁ - объем 0,01 н раствора Na₂S₂O₃, израсходованного на титрование в рабочем опыте, мл; 0,25 - количество гликогена, эквивалентное 1 мл 0,01 н раствора Na₂S₂O₃, мг; v₂ - объем колбы, использованной для разведения гидролизата гликогена, мл; v₃ - объем фильтрата, взятый для обработки окислительным реагентом, мл; m - масса образца, г; 1000 - коэффициент для перевода мг в г.

Дата добавления: 2015-07-13