Фосфоенолпировиноградной кислоты

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 16

(ФОСФОЕНОЛПИРУВАТА) В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ РЫБ

Ц е л ь р а б о т ы - определить содержание фосфоенолпировиноградной кислоты в мышечной ткани свежей рыбы фотоколориметрическим методом.

Фосфоенолпировиноградная кислота является одним из промежуточных продуктов гликолиза в мышечной ткани.

Метод основан на том, что фосфоенолпируват в щелочной среде обнаруживается при окислении йодом с отщеплением неорганического фосфора PO^3-₄. Содержание PO^3-₄ определяется фотоколориметрическим метом, содержание фосфоенолпирувата рассчитывается в мышечной ткани рыбы:

CH₂ CH₃

|| |

C – OPO₃H₂ + J₂ + NaOH C = O + NaJ + J₂ + H₃PO₄

| | Избыток

COOH COOH

J₂ + Na₂S₂O₃ 2NaJ + Na₃S₄O₆

Тиосульфат Тетратионат

натрия натрия

Реактивы, оборудование, материалы:

ФЭК; кюветы с толщиной слоя 1 см; баня ледяная; цилиндры; ТХУ (2,5%-й раствор); гидроксид натрия (2 моль/л раствор); кислота соляная (2 моль/л раствор); йод (0,1 моль/л раствор); тиосульфат натрия (0,05 моль/л раствор); молибдат аммония (1%-й раствор в 0,025 моль/л растворе серной кислоты); кислота аскорбиновая (1%-й раствор); дигидроортофосфат калия (стандартный раствор, 2 ммоль/мл); мышечная ткань рыбы.

Порядок выполнения работы

В пробирку с 5 мл 2,5%-го раствора ТХУ помещают 0,5 г мышечной кашицы из рыбы, экстрагируют на льду в течение 10 мин, постоянно перемешивая смесь.

Прибавляют в пробирку 5 мл дистиллированной воды, раствор фильтруют через бумажный фильтр. Последовательно прибавляют в опытную пробирку 2 мл фильтрата, 1 мл раствора NaOH, 1 мл раствора J₂.

Смесь перемешивают и держат при комнатной температуре 15 мин. В опытную пробирку добавляют по каплям 1-2 мл (до появления характерного для йода неисчезающего бурого окрашивания).

Избыток йода оттитровывают раствором Na₂S₂O₃ до исчезновения бурой окраски (для этого следует прибавить 0,2-0,3 мл раствора тиосульфата натрия). Общий объем доводят до 10 мл и перемешивают. В контрольную пробирку добавляют 2 мл фильтрата, 1 мл 2 М раствора HCl. Общий объем доводят водой до 10 мл, смесь перемешивают. Контрольная проба необходима для учета исходного неорганического фосфора в мышечной ткани рыбы.

Из опытной и контрольной пробирок отбирают по 2 мл раствора, переносят в две другие пробирки.

Добавляют в каждую по 0,5 мл раствора (NH₄)₂MoO₄ и по 0,5 мл раствора аскорбиновой кислоты. Общий объем в каждой пробирке доводят до 10 мл и оставляют пробы на 10 мин при комнатной температуре.

Опытную пробу фотоколориметрируют на ФЭК в кювете с толщиной слоя в 1 см (красный светофильтр, длина волны 670 нм).

Контрольную пробу колориметрируют на ФЭКе при аналогичных условиях.

Расчетные формулы

По калибровочной кривой определяют содержание PO^3-₄, соответствующее контрольной пробе (m₁), и содержание PO^3-₄, соответствующее опытной пробе (m₂).

Содержание фосфоенолпировиноградной кислоты в 100 г мышечной ткани определяют по формуле: Х = Dm_*200_*р,

где Dm = m₂ – m₁ - содержание PO^3-₄, соответствующее фосфоенолпирувату в пробе; 200 - коэффициент пересчета на 100 г мышечной ткани; Р - разведение раствора.

Дата добавления: 2015-07-13