Фотоколориметрическим антроновым методом. Ц е л ь р а б о т ы - определить содержание гликогена в мышечной ткани фотоколориметрическим методом

В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 13

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГЛИКОГЕНА

Ц е л ь р а б о т ы - определить содержание гликогена в мышечной ткани фотоколориметрическим методом.

Производные углеводов типа фурфуролов, образующихся при нагревании глюкозы с H₂SO₄, дают с антроном окрашенные соединения:

O

||

+ HC - R

||

|| O

O

Антрон

O

||

||

H - C - R

Интенсивность окраски определяется фотоколориметрически при длине волны 620 нм.

Реактивы, оборудование, материалы:

Фотоэлектроколориметр; мышечная ткань рыбы.

Антрон (0,2%-й раствор, приготовленный на 95%-м растворе H₂SO₄, готовят перед употреблением и ставят в лед.

Глюкоза (стандартный раствор 100 мг%), готовят на растворе бензойной кислоты (100 мг на 100 мл воды).

Порядок выполнения работы

В центрифужную пробирку помещают 25-100 мг измельченной мышечной ткани рыбы или 1 мл безбелкового фильтрата, добавляют 3 мл 30%-го раствора КОН и нагревают в кипящей водяной бане в течение 20 мин.

Пробы охлаждают, добавляют 4 мл спирта, хорошо перемешивают стеклянной палочкой и помещают в кипящую водяную баню. Когда спирт закипит, пробы охлаждают и осадок гликогена отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин.

При высоком содержании гликогена в пробе определение проводят «прямым» методом, т.е. непосредственно из раствора. Если содержание гликогена в пробе невелико, то перед определением его осаждают спиртом - «непрямой» метод. Предварительное отделение гликогена необходимо и потому, что окраску с антроном могут дать продукты гидролиза белка.

Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок гликогена растворяют в 1 мл воды, добавляют 1 мл спирта. Вторично нагревают пробу до кипения и охлаждают.

Осадок гликогена отделяют центрифугированием, подсушивают на воздухе, растворяют в 2,5 мл воды.

Добавляют 5 мл свежеприготовленного раствора антрона, тщательно перемешивают и ставят в водяную баню при 90 ⁰С.

Через 10 мин пробу охлаждают в бане с ледяной водой. Проба приобретает зеленую со слабым синеватым оттенком окраску.

Измеряют оптическую плотность пробы при длине волны 620 нм. По калибровочной кривой определяют содержание гликогена (в пересчете на глюкозу) в мышечной ткани рыбы.

Для построения калибровочной кривой методом разведения исходя из стандартного раствора глюкозы готовят набор растворов. К 2,5 мл каждого раствора добавляют по 5 мл раствора антрона. Дальнейший ход анализа аналогичен вышеописанному.

Расчетная формула:

Содержание гликогена в 1 г мышечной ткани (в расчете на глюкозу) определяется по формуле Х = А _* 10,

где А - содержание гликогена (в расчете на глюкозу) в 100 мг мышечной ткани, определенное по калибровочной кривой; 10 - коэффициент пересчета на 1 г мышечной ткани.

Дата добавления: 2015-07-13