Фотоколориметрический метод определения

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 20

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 19

Ц е л ь р а б о т ы - количественно определить содержание витамина С в биологическом материале.

Оборудование, реактивы, материалы:

Колбы мерные емкостью 100 мл; колбы конические; кислота аскорбиновая (порошок); кислота соляная (2%-й раствор); иодид калия (1%-й раствор); крахмал (0,5%-й раствор); иодат калия (0,01 н раствор); биологический материал.

Порядок выполнения работы

В мерной колбе емкостью 100 мл растворяют в воде 1 г порошка витамина С (или биологического материала), доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. В коническую колбу емкостью 100 мл помещают 10 мл полученного раствора, прибавляют 1 мл 2%-го раствора соляной кислоты, 0,5 мл 1%-го раствора иодида калия, 2 мл 0,5%-го раствора крахмала, доводят водой до объема, равного 20 мл. Титруют 0,01 н раствором иодата калия до появления стойкого слабо-синего окрашивания.

Параллельно проводят контрольный опыт. В коническую колбу помещают 1 мл 2%-го раствора соляной кислоты, 0,5 мл 1 %-го раствора иодида калия, 2 мл 0,5%-го раствора крахмала, добавляют воду до общего объема 20 мл. Титруют 0,01 н раствором иодита калия до появления стойкого слабо-синего окрашивания.

Расчетная формула

А = Р _* 0,0008806 _* (V₂ - V₁),

где А - содержание витамина С в 1 г порошка; V₂ - объем 0,01 н раствора иодата калия, пошедшего на титрование опытной пробы, мл; V₁ - объем 0,01 н раствора иодата калия, пошедшего на титрование контрольной пробы, мл; Р - разведение; 0,0008806 - содержание

аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,01 н раствора KJO₃, г.

СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА С ПО РЕАКЦИИ С a-ДИПИРИДИЛОМ

Ц е л ь р а б о т ы - определить содержание витамина С в биологическом материале.

Метод основан на восстановлении аскорбиновой кислотой трехвалентного железа в двухвалентное, которое образует с a-дипиридилом комплекс розового цвета. Фотоколориметрирование комплекса проводят при длине волны 525 нм.

Оборудование, реактивы, материалы:

Фотоэлектроколориметр; кюветы с толщиной слоя 0,5 см; пипетки; железо хлорное (3%-й раствор); a-дипиридил (1%-й раствор); кислота ортофосфорная (85%-й раствор); кислота трихлоруксусная (5%-й и 40%-й растворы); биологический материал (сок капусты, картофеля, вытяжка из шиповника или других плодов, раствор витамина С неизвестной концентрации).

Приготовление 1%-го раствора a-дипиридила. В воде a-дипиридил растворяется плохо, поэтому навеску данного реактива смачивают этиловым спиртом. Взвешивают 0,5 г a-дипиридила, добавляют 4 мл спирта, помещают в мерную колбу емкостью 50 мл, доводят дистиллированной водой до метки.

Порядок выполнения работы

К 2 мл исследуемого раствора добавляют 0,3 мл охлажденного 40%-го раствора ТХУ, перемешивают стеклянной палочкой, оставляют на 10 мин на холоде (в воде со льдом) с целью более полной денатурации белков. Центрифугируют 20 мин при 20 000 об/мин. Данный этап проводится только в случае белоксодержащего исходного материала для исследований. Далее к 1 мл надосадочной жидкости добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, 0,1 мл 85%-го раствора ортофосфорной кислоты, 0,8 мл 1%-го раствора a-дипиридила, 0,1 мл 3%-го раствора хлорного железа. Содержимое пробирки после добавления каждого реактива тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин до появления окраски. Окраска стабильна в течение суток. По истечении 30 мин пробы центрифугируют 5 мин при 20 000 об/мин и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 525 нм в кювете с толщиной слоя 5 мл против контрольной пробы (для получения контрольного образца берут 1 мл дистиллированной воды и проводят вышеуказанные операции).

По калибровочному графику определяют содержание витамина С в образце.

Построение калибровочного графика

В 100 мл 5%-го раствора ТХУ растворяют 33,3 мг аскорбиновой кислоты;

10 мл этого раствора вносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доливают до метки 5%-м раствором ТХУ (1 мл такого раствора содержит 0,0333 мг аскорбиновой кислоты). В шест мерных колбочек на 100 мл вносят последовательно 4, 6, 8, 10, 20, 30 мл стандартного раствора и доводят до метки дистиллированной водой.

По 1,5 мл раствора из каждой колбочки вносят в центрифужные пробирки, прибавляют по 0,1 мл 85%-го раствора фосфорной кислоты, 0,8 мл 1%-го раствора a-пиридила, 0,1 мл 3%-го раствора хлорного железа, перемешивают и оставляют на 30 мин для проявления окраски. Перед колориметиррованием пробы центрифугируют в течение 5 мин. Стандартные растворы аскорбиновой кислоты нестойки, поэтому их готовят непосредственно перед исследованием.

Дата добавления: 2015-07-13