В биологическом материале

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА Е

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 24

Ц е л ь р а б о т ы - освоить методы определения витамина Е в биологическом материале.

Оборудование, реактивы, материалы:

Фотоколориметр; кюветы; центрифуга; баня водяная; холодильник обратный; печень; молоко; спирт этиловый (96%-й); бензол; гексан; гидроксид калия (60%-й раствор); эфир диэтиловый; натрий сернокислый (безводный); масляный концентрат витамина Е в ампулах (100 г); реактив железодипиридиловый.

Приготовление железодипиридилового реактива

В 1 л уксусной кислоты растворяют 250 мг хлорного железа и 500 мг a-дипиридила. Реактив можно использовать через 7-10 дней после приготовления. Хранят при комнатной температуре в посуде из темного стекла (срок хранения не ограничен).

Метод заключается в окислении токоферолов хлорным железом и фотоколориметрическом определении оптической плотности желто-коричневого комплекса двухвалентного железа с a- дипиридилом при длине волны 520 нм.

Построение калибровочного графика

Для приготовления стандартных растворов витамина Е используют ампулы, содержащие 100 мг витамина Е (токоферолацетата) в виде масляного концентрата. В колбу емкостью 100-150 мл вносят 2 мл 60%-го раствора КОН, 10 мл этилового спирта и помещают ампулу с концентратом витамина Е. Резким ударом шпателя разбивают ампулу, перемешивают смесь. Колбу соединяют с обратным воздушным холодильником и помещают на 15 мин в водяную баню при температуре 80 ⁰С для омыления липидов. Омыленный раствор охлаждают, разбавляют 20 мл дистиллированной воды и переносят количественно в делительную воронку, в которой производят экстракцию витамина Е бензолом. Для первой экстракции берут 40 мл, для двух последующих - по 20 мл бензола. Экстракты объединяют, промывают в делительной воронке 3-4 раза дистиллированной водой до удаления следов щелочи (проба на лакмусовую бумажку) и обезвоживают 5-7 г сернокислого натрия. Обезвоженный экстракт фильтруют в мерную колбу емкостью 100 мл, а сернокислый натрий промывают на фильтре небольшим количеством бензола, после чего доводят объем экстракта до 100 мл бензолом. Полученный основной стандартный раствор витамина Е (токоферола) имеет концентрацию 90 мг%. Рабочий раствор витамина Е (2,25 мг/100 г) готовят разбавлением основного стандартного раствора в 40 раз (1 мл основного раствора + 39 мл бензола). Из рабочего раствора витамина Е готовят серию калибровочных растворов (табл. 18).

Таблица 18

Номер пробы	Концентрация калибровочных растворов, мкг/мл	Количество рабочего раствора, мл	Количество Бензола, мл
	2,25
	4,50
	6,75
	9,00
	13,50
	18,00

Отбирают по 1 мл каждого раствора, прибавляют по 2 мл железопиридилового реактива, перемешивают. Наблюдается образование желто-коричневых комплексов двухвалентного железа с a-дипиридилом. Одновременно готовят контрольную пробу (1 мл бензола + 2 мл железо-пиридилового реактива). Пробы следует оберегать от света. Через 20 мин производят фотоколориметрирование комплексов при длине волны 540 нм и рабочей длине кюветы 0,5 см. На основании полученных результатов строят калибровочную кривую.

Дата добавления: 2015-07-13