Селективной межклеточной адгезии

Диссоциированные клетки позвоночных могут вновь ассоциироваться в организованную ткань благодаря

Привлекательность использования таких микроорганизмов, как Dictyo-stelium, при изучении агрегации клеток состоит в том, что этот процесс нормально протекает в культуральной чашке, где он доступен для

Рис. 14-62. «Волны» голодающих амеб Dictyostelium, движущихся к центру агрегации. При таком малом увеличении отдельные амебы не видны. (Световая микрофотография; с любезного разрешения Günter Gerisch.)

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

Рис. 14-63. Иммунологический метод идентификации белков плазматической мембраны, участвующих в межклеточной адгезии. На этапе 1 получают антитела (обычно кроличьи) к исследуемым клеткам или к их изолированным плазматическим мембранам. На этапе 2 выделяют и тестируют моновалентные фрагменты, чтобы получить препарат антитела, блокирующий межклеточную адгезию. (Используются моновалентные фрагменты, полученные с помощью протеаз - см. разд. 18.2.4), так как они не сшивают клетки и, таким образом, не вызывают «ложной» адгезии.

Для выявления молекул клеточной поверхности, участвующих в межклеточной адгезии, белки плазматической мембраны солюбилизируют, отделяют друг от друга и каждую фракцию испытывают на способность нейтрализовать действие фрагментов антител, блокирующее агрегацию клеток (этапы 3 и 4). Затем фракции, проявившие такую способность, очищают и вновь тестируют до тех пор, пока не будет получен чистый белок (этот процесс на схеме не показан). Другой Иммунологический подход состоит в получении большого числа моноклональных антител (разд. 4.5.4) к антигенам клеточной поверхности и их скрининге для выявления тех, которые будут блокировать межклеточную адгезию. Оба иммунологических метода основаны на важном общем наблюдении: простое нанесение на клеточную поверхность антител само по себе не препятствует нормальной клеточной адгезии; адгезия блокируется только тогда, когда мишенями для связывания антител служат специфические молекулы клеточной поверхности, участвующие в адгезии.

исследования. К сожалению, такая возможность изучать процессы клеточного узнавания в ходе развития многоклеточных животных представляется редко. Обычно мы можем в лучшем случае диссоциировать клетки формирующейся ткани, а затем испытывать их способность вновь объединяться in vitro. В отличие от тканей взрослого организма, которые трудно разделить на отдельные клетки, эмбриональные ткани позвоночных легко диссоциируют при воздействии малых концентраций прогеолигического фермента трипсина, иногда в сочетании с удалением внеклеточного кальция с помощью подходящего хелатора (например, ЭДТА). Эти воздействия нарушают межбелковые взаимодействия (многие из которых зависят от Са2 +, см. разд. 14.3.7), удерживающие клетки вместе. Поразительно то, что такие диссоциированные клетки часто вновь объединяются in vitro в структуры, напоминающие исходную ткань. Таким образом, структура ткани не является только результатом процесса развития, а активно поддерживается и стабилизируется системой взаимного сродства клеток друг к другу и к внеклеточному

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

матриксу. Поэтому можно надеяться, что изучение реагрегации диссоциированных клеток в культуре поможет выяснить роль адгезии между клетками и между клетками и матриксом в создании и поддержании организации тканей.

В этом смысле поучительны эксперименты на культивируемых клетках эпидермиса (эпителия кожи). В этой ткани решающую роль в удерживании вместе клеток, называемых кератиноцитами, в многослойном пласте на базальной мембране играют Са2+-зависимые адгезионные системы. Кератиноциты в базальном слое кожи - относительно недифференцированные клетки, они быстро пролиферируют и поставляют новые клетки в верхние слои, где клеточные деления прекращаются и происходит окончательная дифференцировка (разд. 17.4.2). Помещенные на подходящий субстрат в культуре, диссоциированные кератиноциты будут точно так же делиться и дифференцироваться. Однако если в культуре поддерживать концентрацию Са2+ ниже нормы, то Са2+-за-висимые адгезионные системы не смогут действовать и кератиноциты будут расти в виде

монослоя, где перемещаны как делящиеся, так и дифференцирующиеся клетки. Если затем повысить концентрацию Са2 +, то пространственная организация клеток вскоре изменится; монослой преобразуется в многослойный эпителий, где пролиферирующие клетки образуют базальный слой, прилегающий к субстрату, а дифференцирующиеся клетки выделяются в верхние слои, так же как и в нормальной коже. Это позволяет предполагать, что послойное расположение кератиноцитов в зависимости от состояния их дифференцировки поддерживается Са2 +-зависимыми механизмами межклеточной адгезии (см. рис..4-68).

14.3.5. Реагрегация диссоциированных клеток позвоночных зависит от тканеспецифических систем узнавания [32]

При нормальном развитии большинства тканей не встречается сортировка случайно перемешанных клеток разных типов (разд. 16.4). Тем не менее, если диссоциированные эмбриональные клетки из двух разных тканей позвоночного, например из печени и сетчатки, перемешать, то эти агрегаты из перемешанных клеток будут постепенно рассортировываться в соответствии с тканевой принадлежностью клеток. Такой тест, по-

видимому, выявляет тканеспецифические системы межклеточного узнавания, которые удерживают вместе клетки в развивающейся ткани.

Подобные системы узнавания можно продемонстрировать и другим способом. Как показано на рис. 14-65, диссоциированные клетки легче слипаются с агрегатами своей собственной ткани, чем с агрегатами других тканей. Таким образом, два разных теста - определение степени сродства клеток в опытах с длительной инкубацией (рассортировка клеток) и оценка тенденции клеток присоединяться к уже имеющимся агрегатам - дают сходный результат.

Какова молекулярная основа такой избирательной межклеточной адгезии у позвоночных? По-видимому, здесь, как и у слизевиков, ответственны два разных механизма межклеточной адгезии, один из которых Са2+-независимый, а другой - Са2 +-зависимый, и в каждом из них участвует особое семейство гомологичных гликопротеинов клеточной поверхности.

Рис. 14-64. Три возможных способа взаимодействия между молекулами клеточной поверхности в процессе межклеточной адгезии.

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

Рис. 14-65. Тканеспецифическая адгезивность диссоциированных эмбриональных клеток позвоночных по данным теста со связыванием радиоактивных клеток. Адгезивность можно оценить, определив число меченых клеток, связавшихся с клеточными агрегатами за тот или иной промежуток времени. Склонность к адгезии выше между клетками одного типа. В часто используемой модификации этого теста клетки метят флуоресцентным или радиоактивным маркером и исследуют их связывание с монослоем немеченых клеток в культуре.

14.3.6. У позвоночных в Са2 +-независимой межклеточной адгезии участвуют гликопротеины плазматической

мембраны из суперсемейства иммуноглобулииов; таковы, например, молекулы адгезии нервных клеток (N-CAM)

Для идентификации некоторых гликопротеинов клеточной поверхности, участвующих в межклеточной адгезии у позвоночных, был использован иммунологический метод, представленный на рис. 14-63. В одном из наиболее изученных примеров были получены фрагменты моновалентного антитела к клеткам сетчатки куриного эмбриона. Затем были отобраны антитела, ингибирующие реагрегацию этих клеток in vitro.

Мембранные белки клеток сетчатки были затем фракционированы и испытаны на способность нейтрализовать блокирующую активность антител.

Таким путем был идентифицирован крупный (около 1000 аминокислотных остатков) трансмембранный гликопротеин, названный молекулой

адгезии нервных клеток (N-CAM). N-CAM экспрессируется на поверхности нервных и глиальных клеток (разд. 19.1.6), «склеивая» их при участии Са2 +-независимого механизма. Если такие мембранные белки очистить и ввести в синтетические фосфолипидные пузырьки, то эти пузырьки будут склеиваться друг с другом, а также с клетками, имеющими N-CAM на своей поверхности; однако склеивание блокируется, если клетки предварительно обработать моновалентными антителами к N-CAM. Это указывает на то, что N-CAM связывает клетки друг с другом с помощью гомофильного взаимодействия, непосредственно соединяющего две молекулы N-CAM(CM. рис. 14-64).

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

Антитела к N-CAM нарушают нормальный ход развития сетчатки в тканевой культуре, а при введении в развивающийся глаз цыпленка препятствуют нормальному росту аксонов нервных клеток сетчатки. Как мы увидим позже (разд. 19.7.8), это позволяет предполагать, что N-CAM играет важную роль в развитии центральной нервной системы, способствуя межклеточной адгезии. Кроме того, клетки нервного гребня, формирующие периферическую нервную систему, находясь в составе нервной трубки, имеют большое количество N-CAM на своей поверхности и теряют его при миграции. Но когда они агрегируют, образуя ганглии, N-CAM появляется вновь (см. рис. 14-56), что указывает на важную роль NCAM в построении ганглия. N-CAM экспрессируется также во время критических стадий в развитии многих ненервных тканей, где, как полагают, эти молекулы способствуют удержанию вместе специфических клеток.

Существует несколько форм N-CAM, каждая из которых кодируется отдельной мРНК. Разные мРНК образуются при альтернативных вариантах сплайсинга РНК-транскрипта одного и того же крупного гена. У большинства форм N-CAM большая внеклеточная часть полипептидной цепи (около 680 аминокислотных остатков) идентична и организована в виде пяти доменов, гомологичных доменам иммуноглобулинов, характерным для молекул антител (разд. 18.3.3). Таким образом, N-CAM принадлежит к тому же древнему суперсемейству «белков узнавания», что и антитела (разд. 18.6.20). Разные формы N-CAM различаются главным образом сегментами, связанными с мембраной, и цитоплазматическими доменами и поэтому могут по-разному взаимодействовать с цитоскелетом; в самом деле, одна из форм не пронизывает липидный бислой и соединена с плазматической мембраной только ковалентной связью с фосфатидилинозитолом (разд. 8.6.13) (рис. 14-66), в то время как другая секретируется и встраивается во внеклеточный матрикс. Каковы функциональные различия всех этих форм, не известно.

У позвоночных находят все больше гликопротеинов клеточной поверхности, осуществляющих Са2 +-независимую межклеточную адгезию, которые принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов. Однако не все поверхностные белки, участвующие в такой адгезии, относятся к этому суперсемейству; например, те, которые функционируют только в присутствии внеклеточных ионов Са2 +, принадлежат к другому семейству.

Дата добавления: 2015-08-31