Определение количества белка турбидиметрическим методом с сульфосалициловой кислотой

Измерение напряжения электронными вольтметрами прямого преобразования.

Для той же формы несинусоидального периодического сигнала (форму сигнала см. в индивидуальном задании № 4) найти все его параметры по показаниям электронного вольтметра. Показания вольтметра задать самостоятельно. Задачу решить для всех вольтметров вида В3 и вольтметра вида В4 с открытым и закрытым входами.

Рекомендуемая литература

1. Новицкий П.В., Зограф И.А. Оценка погрешностей результатов измерений. – Л.: Энергоатомиздат. Ленингр. отд – ние, 1985. – 248с.

2. Селиванов М.Н., Фридман А.Э., Кудряшова Ж.Ф. Качество измерений: Метрологическая справочная книгаю – Л.: Лениздат, 1987. – 295с.

3. Рабинович С.Г. Погрешности измерений. – Л.: Энергия. 1978, - 262с.

4. Эрастов В.Е. Метрология, стандартизация и сертификация: Учеб. пособие. – Томск: Изд – во Томск. гос. Ун – та систем упр. И радиоэлектроники, 2005. – 266с.

Принцип. Сульфосалициловая кислота вызывает денатурацию белка с появлением мутности, интенсивность которой пропорциональна количеству белка.

Реактивы.

1. 3% раствор сульфосалициловой кислоты (ССК).

2. 0,9% раствор хлорида натрия.

3. Стандартный 1% раствор альбумина.

Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр (ФЭК).

Ход исследования. В 2 пробирки (опыт и контроль) наливают по 1,25мл профильтрованной мочи. В опытную пробирку добавляют 3,75мл 3% раствора ССК, а в контрольную – 3,75 мл 0,9% раствора хлорида натрия и перемешивают содержимое пробирок. Через 5 минут измеряют оптическую плотность опытной пробы на ФЭКе при длине волны 590-650нм (светофильтр оранжевый или красный), в кювете на 5мм, против контрольной пробы.

Концентрацию белка определяют по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика из стандартного 1% раствора альбумина готовят разведения в соответствии с таблицей 6. Из каждого полученного разведения берут 1,25мл и обрабатывают как опытные образцы.

Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1г/л. При более высокой концентрации белка мочу следует развести и учитывать разведение при расчетах.

Таблица 6

Приготовление разведений для построения калибровочного графика

№№	1% раствор альбумина, мл	0,9% раствор NaCl, мл	Концентрация белка, г/л
	0,05	9,95	0,05
	0,1	9,9	0,1
	0,2	9,8	0,2
	0,5	9,5	0,5
	1,0	9,0	1,0

Определение концентрации белка в моче с пирогаллоловым красным

Принцип. При взаимодействии белка с красителем пирогаллоловым красным образуется окрашенный комплекс, интенсивность поглощения которого на длине волны 600нм увеличивается с ростом концентрации белка в пробе.

Реактивы поставляются в наборе: раствор пирогаллолового красного и молибдата натрия в сукцинатном буфере, калибровочные растворы белка 1г/л и 0,2г/л.

Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр или специальный фотометр МИКРОЛАБ-600 для определения концентрации белка.

Ход исследования. Приготовить пробы смешением компонентов в количестве, указанном в таблице 7.

Таблица 7

Приготовление проб

Компоненты	Холостая проба	Калибровочная проба 1г/л	Опытная проба
Образец	-	-	20мкл
Калибровочный раствор 1,0 г/л	-	20мкл	-
Вода дистиллированная	20мкл	-	-
Реагент	1мл	1мл	1мл

После смешения компонентов пробы инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Окраска стабильна в течение 30 минут после завершения инкубирования. Измеряют оптическую плотность опытных проб и калибровочной пробы в кюветах на 1см при длине волны 600нм против холостой пробы.

Расчет ведут по формуле:

С = , где С – концентрация белка в пробе,

D_{образец} – оптическая плотность опытной пробы,

D_{стандарт} – оптическая плотность калибровочной пробы.

Если результат определения более 1,9г/л, следует развести исследуемый образец в 2 или более раза дистиллированной водой, повторить тест и результат умножить на степень разведения. Если концентрация белка менее 0,07г/л и требуется уточнение результата, повторить анализ с калибровочной пробой 0,2г/л при соотношении образец/реагент=1:10.

1.2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В МОЧЕ

В моче здоровых людей глюкозы практически нет, так как вся она, перешедшая с фильтратом в первичную мочу, реабсорбируется затем в почечных канальцах. Появление глюкозы в моче называется глюкозурия. Как правило, глюкозурия является следствием гипергликемии (увеличения содержания глюкозы в крови) выше 7-9 ммоль/л. Эта концентрация соответствует почечному порогудля глюкозы.

Почечный порог – это определенное содержание вещества в крови, выше которого данное вещество полностью не реабсорбируется, и часть его выделяется с мочой. Вещества, которые в нормальной моче не содержатся, а появляются в ней только после увеличения в крови выше определенного уровня, называются пороговыми.К пороговым веществам относятся глюкоза, аминокислоты, билирубин, ионы калия, фосфора. Появление пороговых веществ в моче всегда свидетельствует о патологии.

Глюкозурии делятся на инсулярные и экстраинсулярные. Инсулярные глюкозурии развиваются при недостатке в организме инсулина – гормона поджелудочной железы, который вырабатывается β-клетками островков Ларгенганса и является единственным в организме гипогликемическим гормоном, то есть гормоном, снижающим уровень глюкозы в крови. При недостатке инсулина содержание глюкозы в крови увеличивается выше почечного порога, что приводит к глюкозурии. Инсулярная глюкозурия характерна для сахарного диабета.

Экстраинсулярные глюкозурии не связаны с выработкой инсулина, а зависят от других факторов. Они могут быть физиологические (временные, у здоровых людей) и патологические (при заболеваниях). Физиологические глюкозурии появляются при чрезмерном употреблении сахара или меда – алиментарные [от лат. alimentum пища], стрессовых ситуациях (нейрогенные), приеме некоторых лекарственных препаратов (лекарственные).

Патологические экстраинсулярные глюкозурии могут иметь разное происхождение: гормональное, центральное, почечное. Гормональные глюкозурии, не связанные с инсулином, возникают при гиперфункции (усиленной работе) желез внутренней секреции, вырабатывающих гормоны с гипергликемическим действием:

- гипофиза (адренокортикотропный гормон – АКТГ);

- щитовидной железы (тироксин);

- надпочечников (адреналин, глюкокортикоиды).

Глюкозурии центрального происхождения выявляются при травмах и опухолях головного мозга, отравлении угарным газом, воспалительных заболеваниях мозга и мозговых оболочек (менингитах, энцефалитах), а также при кровоизлиянии в мозг.

Почечные глюкозурии обусловлены снижением почечного порога для глюкозы, то есть уменьшением способности почечных канальцев реабсорбировать глюкозу. При этом глюкоза выделяется с мочой даже при нормальном содержании ее в крови. Глюкозурии почечной природы встречаются при почечном диабете и хронических заболеваниях почек.

У больных со сморщенными почками глюкозурия может отсутствовать, несмотря на значительную гипергликемию, что зависит от уменьшения фильтрации глюкозы через склерозированные клубочки.

Таблица 8

Причины и виды глюкозурий

Инсулярные глюкозурии	Экстраинсулярные глюкозурии
Физиологические	Патологические
Сахарный диабет	Алиментарные Нейрогенные Лекарственные	Гормональные Центрального происхождения Почечные

Методы определения глюкозы в моче. Определение глюкозы является обязательным компонентом общего анализа мочи. Вначале проводят качественное определение глюкозы одним из методов:

- унифицированной пробой Гайнеса;

- с помощью тест-полосок типа «Глюкотест».

Если глюкоза в моче обнаружена, то проводят ее количественное определение унифицированными методами:

- на поляриметре. Метод основан на способности раствора глюкозы вращать поляризованный луч света вправо. В настоящее время используется редко, так как трудоемок и дает неточные результаты, если не достигнута полная прозрачность мочи;

- по цветной реакции с ортотолуидином;

- ферментативным глюкозооксидазным методом, который является наиболее точным и специфичным.

Количество глюкозы в моче выражается в ммоль/л. 1ммоль/л = 55,51% глюкозы.

Качественное определение глюкозы в моче пробой Гайнеса

Принцип. Метод основан на способности глюкозы восстанавливать в щелочной среде при нагревании гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (желтого цвета) и закись меди (красного цвета).

Реактивы. Реактив Гайнеса:

1) 13,3г кристаллического сульфата меди растворяют в 400мл дист. воды;

2) 50г едкого натра растворяют в 400мл дист. воды;

3) 15г глицерина растворяют в 200мл дист. воды;

4) смешивают растворы 1 и 2 и тотчас приливают раствор 3.

Получается раствор синего цвета, стойкий при хранении.

Ход исследования. К 3-4 мл реактива Гайнеса добавляют 8-12 капель мочи, содержимое пробирки перемешивают. Ставят в кипящую водяную баню на 1 минуту. При наличии глюкозы в моче содержимое пробирки приобретает оранжевый, красный или бурый цвет. Если глюкозы в моче нет, то синий цвет реактива не меняется.

Проба Гайнеса не является специфической для глюкозы. Кроме глюкозы, эту пробу дают и другие вещества, обладающие восстанавливающими свойствами (мочевая кислота, креатинин, индикан, желчные пигменты и др.).

Определение глюкозы в моче с помощью индикаторных тест-полосок типа «Глюкотест»

Принцип. Метод основан на специфическом окислении глюкозы ферментом глюкозооксидазой. Образовавшаяся при этом перекись водорода разлагается пероксидазой с выделением атомарного кислорода, который окисляет краситель с изменением его цвета.

Ход исследования. Полоску погружают в мочу, чтобы смочилась индикаторная зона. Сразу же помещают полоску на пластмассовую пластинку. Через 2 минуты читают результат, сравнивая цвет индикаторной зоны с прилагаемой шкалой.

Моча для исследования на глюкозу должна быть свежесобранной, так как при хранении глюкоза быстро разлагается микроорганизмами.

1.2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЕТОНОВЫХ ТЕЛ В МОЧЕ

Кетонурия (ацетонурия) - это выделение с мочой кетоновых (ацетоновых) тел. К ацетоновым телам относятся ацетон, ацетоуксусная кислота и β-оксимасляная кислота. В моче здоровых людей они содержатся в следовых количествах и обычными качественными пробами не выявляются.

Кетоновые тела появляются в моче при сахарном диабете, голодании. При этом моча приобретает резко кислую реакцию и запах ацетона (прелых фруктов). Иногда кетонурия бывает у детей при погрешностях в питании. Это так называемая «ацетонемическая рвота», не имеющая большого диагностического значения.

Методы обнаружения кетоновых тел в моче. Определение кетоновых тел не входит в общий анализ мочи, относится к дополнительным методам химического исследования. Проводится по специальному назначению врача, а также в тех порциях мочи, в которых была обнаружена глюкоза. Кетоновые тела в моче определяют качественно или полуколичественно. Точное определение количества кетоновых тел в моче не проводится, так как они выделяются из организма не только с мочой, но и с пóтом, и с выдыхаемым воздухом.

Для определения кетоновых тел используются унифицированные методы:

- проба Ланге с нитропруссидом натрия;

- экспресс-методы (реактивные полоски, таблетки, порошок), основанные на том же принципе, что и проба Ланге.

Дата добавления: 2014-11-29