Актуальность

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛАСТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА С ПРИЗНАКАМИ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ДИСПЛАЗИИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ

Копач К.В. (3 курс, лечебный факультет), Хвалько Н.А. (3 курс, лечебный факультет)

Научные руководители: д.м.н. Немцов Л.М.; ст. преподаватель Поплавец Е.В.

УО «Витебский государственный медицинский университет»,

г. Витебск

Эластазы – группа ферментов, обладающих протеолитической активностью, то есть способностью расщеплять белок. Эластаза быстро гидролизирует эластин – фибриллярный белок соединительной ткани, который формирует эластичные волокна, содержащиеся в больших количествах в легких, коже и других тканях. Она способна гидролизировать денатурированный гемоглобин, казеин, фибрин, альбумин и денатурированный (но не интактный) коллаген и имеет значение в развитии эмфиземы легких, атеросклероза, поражения сосудов при остром некрозе поджелудочной железы. Активность эластазы угнетается ингибиторами протеаз, такими как альфа-1-антитрипсин, альфа-1-химотрипсин, антитромбин III, альфа-2-макроглобулин и бета-1-антиколлагеназа. У пациентов с патологией щитовидной железы активность эластазы снижена.

Существует несколько видов эластазы, основными из которых являются две формы: панкреатическая (эластаза-1), содержащаяся в ацинарных клетках экзокринной части поджелудочной железы, и нейтрофильная (эластаза-2), которая находится в азурофильных гранулах цитоплазмы нейтрофилов.

Нейтрофильная (лейкоцитарная) эластаза играет роль в различных воспалительных процессах, эмфиземе легких, сепсисе, артрите, нефрите, буллезном пемфигоиде. Определение активности данной формы фермента применяется в научно-исследовательских работах, его диагностическая ценность для различных патологических процессов изучается.

Панкреатическая эластаза является высокоспецифичным для поджелудочной железы ферментом, который присутствует в составе поджелудочного секрета и участвует в процессах пищеварения. В норме ее содержание в крови минимальное и быстро инактивируется ингибиторами протеаз. Однако при острых воспалительных процессах в поджелудочной железе, таких как острый панкреатит или обострение хронического панкреатита, активность фермента в крови значительно возрастает. Ее уровень повышается в первые 48 часов, на субклинической стадии, что предшествует повышению амилазы и липазы. При этом он не коррелирует со степенью деструкции железы. Повышенная активность фермента в крови сохраняется дольше, чем у амилазы и липазы, и это позволяет не только диагностировать острый процесс, но и подтверждать ранее предположенный диагноз.

Исследование уровня панкреатической эластазы в крови используется для диагностики или исключения острого панкреатита, обострения хронического панкреатита или реактивного воспаления поджелудочной железы при желчнокаменной болезни.

Целью данной работы явилось изучение эластазной активности сыворотки крови у юношей призывного возраста с признаками недифференцированной дисплазии соединительной ткани для определения диагностической информативности использования данного метода в качестве критериев раннего выявления патологии гастродуоденальной зоны.

Материалы и методы. Проведено одномоментное пилотное исследование диагностической информативности эластазной активности сыворотки крови у юношей призывного возраста (16-27 лет). Объектом исследования послужили 11 юношей призывного возраста, проходившие обследование в кардиологическом отделении УЗ «Вторая Витебская областная клиническая больница». Для данной группы пациентов характерны патологии сердечно-сосудистой системы:артериальная гипертензия, НЦА,пролапс митрального, митральная регургитация и другие.

Группу сравнения составили 50 практически здоровых донора, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой.

Нами была использована модифицированная методика определения активности эластазы в биологических жидкостях, которая была предложена Гюн-Хван и Ким Хен [ 15 ]. Сущность модификации заключалась в том, что вместо дорогостоящих фильтров, предназначенных для извлечения из раствора остатков эластин-Конго красного, было применено осаждение субстрата путём центрифугирования [6 найти и указать источник!!! ].

Для определения эластазной активности пробы, содержащие сыворотку крови, перед использованием осаждали центрифугированием в течение 7 мин. (10 тыс. об/мин; центрифуга MICRO 120). Для постановки метода использовали эластин-Конго красный (диаметр частиц 37-75 микрон, производство Sigma) в концентрации 0,8 мг на 1 мл буфера как субстрат для фермента, сыворотки и 2 серии буферных растворов (0,2 М солянокислый трис-буфер) с pH 7,4 и 8,8, так как существует несколько разновидностей эластазы: панкреатическая с оптимумом pH 8,8 и нейтрофильная с оптимумом pH 7,4. Эластаза расщепляла эластин, и конго-красный переходил в раствор, изменяя его цвет с бесцветного на красный с максимальным спектром поглощения 495 нм).

Конго-красный переходит в р-р, изменяя его цвет с бесцветного на красный с спектром поглощения при длине волны 495 нм.

Для удобства постановки вместо пробирок использовались эппендорфы. В один ряд эппендорфов вносили последовательно: 400 мкл раствора эластин-Конго красного на трис-НС1 буфере pH 7,4 и 100 мкл сыворотки крови или ротовой жидкости. Во второй ряд - по 400 мкл раствора эластин-Конго красного на трис-HCl буфере pH 8,8 и 100 мкл сыворотки крови. Контролем служили пробы, содержащие буферный раствор с соответствующим pH в количестве 400 мкл и 100 мкл сыворотки крови. Далее проводили инкубацию проб в термостате при t=37°C в течение 24 ч. Затем пробы извлекали из термостата и центрифугировали в течение 7 мин (10 тыс об/мин; MICRO 120) для осаждения оставшегося эластина-Конго красного в виде не разрушенных частиц. Из надосадка брали в дублях по 150 мкл раствора и переносили в лунки 96 луночного полистиролового планшета. Планшет помещали в многоканальный спектрофотометр Ф300, где при длине волны 492 нм (максимально близкой к 495 нм) определяли оптическую плотность в лунках. Результат выражался в оптических единицах (JE0n) рассчитывался как разница оптических плотностей опытных проб и соответствующих им контрольных

Для определения БАПНА-амидазной активности сывороток в качестве субстрата протеолиза использовали бензоиларгинин-р-нитроанилид. Выбор субстрата обусловлен тем, что распад БАПН А происходит только в результате расщепления амидной (аналога пептидной) связи по аминокислотам Arg-Lis. В лунки плоскодонного стерильного планшета для ИФА вносилось 0,2 мл раствора БАПНА (24 мг БАПНА растворяется в 0,9 мл диметилсульфоксида и доводится до 30 мл 0,05М трис-NaOH буфером-рН 7,4) и 0,005 мл исследуемой сыворотки. Учет результатов реакции осуществлялся после 20-ти часовой инкубации при температуре 37,6°С на анализаторе иммуноферментном фотоэлектрическом при длине волны 410 нм. Для пересчета полученного результата в пикокаталы нами была использована формула:

Y = 0,028+ИхЕоп

Где Y - искомый результат;

Е_оп - оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля. [9].

Результаты исследования:

фамилия		опыт1		опыт 2		контроль1	контроль2	Е. оптического образца
Андрианов		0,249		0,254		0,138	0,098	0,267
Королев		0,156		0,258		0,102	0,071	0,241
Садовский		0,244		0,301		0,082	0,083	0,38
Зимин		0,186		0,188		0,098	0,105	0,171
Кудрявцев		0,201		0,198		0,111	0,111	0,177
Парфелов		0,208		0,206		0,101	0,105	0,208
Плотников		0,45		0,401		0,099	0,078	0,674
Радкевич		0,265		0,249		0,148	0,108	0,258
Симаков		0,263		0,27		0,108	0,1	0,325
Филипович		0,171		0,168		0,214	0,11	0,015
Шпаков		0,215		0,217		0,099	0,108	0,225

Выводы: Таким образом, эластазная активность сыворотки крови повышается при развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы. Дальнейшее изучение активности эластазы сываротки крови при развитии патологий сердечно- сосудистой системы позволит разработать неинвазивные диагностические тесты для повышения качества оказания медицинской помощи данной категории пациентов.

Литература:1. Ohman, D. E. Isolation and characterization of a Pseudomonas aeruginosa PAO mutant that produces altered elastase / D. E. Ohman, S. J. Cryz, B. H. Iglewski // J. Bacteriol. – 1980. – № 142. – P. 836–842.

Дата добавления: 2015-05-08