Молочной кислоты

КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 17

Ц е л ь р а б о т ы - обнаружить и количественно определить содержание молочной кислоты в мышечной ткани рыб.

Анаэробный гидролиз - это распад глюкозы до молочной кислоты в отсутствии кислорода; гликогенолиз - распад гликогена.

Гликолиз и гликогенолиз обеспечивают возможность выполнения организмом физиологических функций в условиях недостаточного снабжения тканей и органов кислородом. Для животных организмов характерен распад гликогена в мышечной ткани.

Суммарное уравнение анаэробного гликолиза:

C₆H₁₂O₆ + 2H₃PO₄ + 2AДФ 2CH₃CHCOOH + 2АТФ + 2H₂O

|

OH H

Промежуточный этап: |

CH₃ – C – COOH CH₃ – C - COOH

|| Лактатдегидрогеназа |

O OH

Пировиноградная Молочная

кислота кислота

1. Качественное определение молочной кислоты реакцией с вератролом.

Метод основан на том, что при инкубации глюкозы в присутствии ферментов мышечной кашицы имеет место гликолиз с образованием молочной кислоты. Молочная кислота под действием концентрированной H₂SO₄ превращается в уксусный альдегид, который при взаимодействии с вератролом (диметиловый эфир пирокатехина) дает розовое соединение.

Реактивы, оборудование, материалы:

Буфер фосфатный (рН = 8,0); глюкоза (1%-й раствор); ТХУ (10%-й раствор); сульфат меди (полунасыщ. раствор); гидроксид кальция (порошок); кислота серная (конц.); вератрол (0,1%-й раствор спиртовой); термостат; баня водяная; цилиндры; бюретки; пробирки;

мышечная кашица из рыбы.

Порядок выполнения работы

П р и г о т о в л е н и е и н к у б а ц и о н н о й с м е с и:

В две пробирки (опытную и контрольную) вносят по 3 мл фосфатного буфера (рН = 8,0) и по 1 мл 1%-го раствора глюкозы.

В контрольную пробирку приливают 1 мл 10%-го раствора ТХУ для предотвращения действия ферментов гликолиза. Содержимое пробирок хорошо перемешивают.

В обе пробирки добавляют по 1 г свежеизмельченной мышечной кашицы из рыбы; доливают по 8-10 капель вазелинового масла для предотвращения контакта инкубационной смеси с кислородом воздуха. Обе пробирки инкубируют в термостате при 37 ⁰С в течение 1,5 ч.

О с а ж д е н и е б е л к о в:

По окончании инкубации пробирки вынимают из термостата. В опытную пробирку добавляют 1 мл 10%-го раствора ТХУ для осаждения белков и прекращения гликолиза. Содержимое каждой пробирки отфильтровывают в две чистые пробирки.

О с а ж д е н и е у г л е в о д о в:

В две пробирки, содержащие безбелковый фильтрат, добавляют по 1 мл полунасыщенного раствора CuSO₄ и по 0,5 г порошка CaSO₄. Пробирки закрывают пробками, встряхивают в течение 15 мин и фильтруют. Осадок на фильтре отбрасывают.

О б н а р у ж е н и е м о л о ч н о й к и с л о т ы:

Пробирки с фильтратом помещают в воду со льдом и медленно по каплям прибавляют по 1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирки следует осторожно втсряхнуть и следить, чтобы их содержимое не нагревалось.

Для ускорения процесса окисления молочной кислоты обе пробирки переносят в кипящую баню на 4 мин, а затем быстро охлаждают в ледяной воде. После охлаждения в каждую пробирку добавляют по 1-2 капли 0,1%-го раствора вератрола, осторожно встряхивают несколько минут.

В ы в о д: В опытной пробе развивается ярко-розовое окрашивание, поскольку под влиянием ферментов мышечной ткани произошел гликолиз с образованием молочной кислоты. В контрольной пробирке окраска слаборозовая за счет молочной кислоты, которая присутствовала в мышечной кашице до начала опыта.

2. Обнаружение молочной кислоты в мышечной ткани с помощью реакции Уффельмана.

Метод основан на том, что молочная кислота в присутствии фенолята железа (реактив Уффельмана), окрашенного в фиолетовый цвет, образует лактат железа желто-зеленого цвета:

3C₆H₅OH + FeCl₃ (C₆H₅O)₃Fe + 3HCl

Фенолят

железа

(C₆H₅O)₃Fe + 3CH₃CHOHCOOH 3C₆H₅OH +

Фенолят Молочная кислота

+ (CH₃CHOHCOO)₃Fe

Лактат

Реактивы, оборудование, материалы:

Пробирки; цилиндры; фенол (1%-й раствор); железо хлорное (1%-й раствор); ткань мышечная; реактив Уффельмана.

Порядок выполнения работы

Мышечную ткань рыбы измельчают ножницами, растирают 1 г в ступке с небольшим количеством песка в течение 3 мин, прибавив 5 капель воды для получения гомогенной массы.

Прибавляют 3 мл воды, перемешивают, фильтруют через смоченную водой вату.

К реактиву Уффельмана (20 капель 1%-го раствора фенола, 2 капли 1%-го раствора хлорного железа) по каплям добавляют 15 капель фильтрата до появления фиолетового цвета.

В ы в о д: В присутствии молочной кислоты фиолетовая окраска жидкости переходит в желто-зеленую, так как образуется лактат железа.

3. Количественное определение молочной кислоты в мышечной ткани рыбы (по Баркеру и Саммерсону).

Метод основан на изменении интенсивности окраски соединения, образующегося при взаимодействии ацетальдегида с n-оксидифенилом в присутствии H₂SO₄. Уксусный альдегид образуется при нагревании молочной кислоты с минеральными кислотами. При его взаимодействии с n-оксидифенилом образуется диоксифенилэтан, дающий продукт фиолетового цвета. Интенсивность фиолетовой окраски пропорциональна концентрации молочной кислоты.

CH₃CHCOOH CH₃ – C = O + H – C = O

| | |

OH H H

Молочная Уксусный Муравьиная

кислота альдегид кислота

CH₃ – C =O + 2HO

|

H

Ацетальдегид n-гидроксидифенил

|

CH₃ – C – H

|

1,1-диоксидифенилэтан

Метод позволяет определить молочную кислоту в количестве от 0,03 до 0,2 мкмоль в пробе. Определение проводится фотоколориметрически при рабочей длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя в 1 см.

Оборудование, реактивы, материалы:

ФЭК; кюветы; кальций молочнокислый (лактат, 0,25_*10^{-3 М раствор, для построения калибровочной кривой);} n-оксидифенил (1,5%-й раствор в 0,5%-м растворе NaOH); кислота серная (конц.); купорос медный (4%-й и 20%-й растворы); оксид кальция (порошок); ткань мышечная рыб; ТХУ (5%-й раствор).

Приготовление n-оксидифенила. Навеску n-оксидифенила в 75 г помещают в коническую пробирку и растворяют в 0,5 мл 5%-го раствора NaOH, добавляют 4,5 мл прокипяченной теплой воды.

Порядок выполнения работы

Готовят вытяжку из мышечной ткани рыбы (5г мышечной кашицы + 20 мл воды). Для получения безбелкового фильтрата проводят осаждение белков с помощью 5%-го раствора ТХУ и отфильтовывают пробу. Дальнейший анализ проводят с безбелковым фильтратом.

В центрифужную пробирку вносят 2 мл безбелкового фильтрата. Для удаления углеводов добавляют 0,5 мл 20%-го раствора медного купороса, доводят объем до 5 мл, добавляют 0,5 г CaO и тщательно перемешивают.

Через 30 мин центрифугируют, отбирают 0,5 мл прозрачного раствора центрифугата в сухую пробирку и помещают в ледяную воду.

Добавляют 1 каплю 4%-го раствора CuSO₄ и медленно при постоянном перемешивании добавляют 3 мл концентрированной H₂SO₄.

Пробирку ставят в кипящую водяную баню на 5 мин (при этом происходит превращение молочной кислоты в ацетальдегид).

Пробу охлаждают до 20 ⁰С в холодной воде, добавляют в пробирку 2-3 капли щелочного раствора n-оксидефинила, осторожно перемешивают и ставят в водяную баню при 30 ⁰С.

Через 30 мин пробирку погружают на 90 с в кипящую водяную баню и охлаждают до комнатной температуры.

Пробу фотоколориметрируют при рабочей длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Содержание молочной кислоты определяют по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой готовят набор растворов лактата кальция, исходя из стандартного (0,25_*10^-3 моль/л). Пробы (по 2 мл) обрабатывают как опытные.

Контрольные вопросы

1. Каковы биологические функции углеводов?

2. Приведите примеры важнейших моносахаридов гидробионтов?

3. Назовите олигосахариды, имеющие большое значение для организма.

4. Перечислите основные гомополисахариды.

5. Какова биологическая роль гликогена в организме?

6. Какова биологическая роль гетерополисахаридов (мукополисахаридов)?

7. Составьте схему распада углеводов в желудочно-кишечном тракте. Охарактеризуйте пищеварительные карбогидразы.

8. Объясните схему аэробного непрямого распада. Каков энергетический баланс процесса?

9. Как протекает аэробный прямой распад углеводов? Каков энергетический баланс пентозного распада?

10. Какова схема анаэробного гликолиза? Каков энергетический баланс данного процесса? Что является конечным продуктом?

11. Что такое гликогенолиз?

12. Объясните понятие «глюконеогенез».

13. Какие ферменты участвуют в переваривании углеводов?

14. Приведите примеры тканевых ферментов углеводного метаболизма.

15. Каковы особенности углеводов гидробионтов?

16. Объясните реакцию Майара. Каково ее значение для технологических процессов?

17. Формулы рационального питания для углеводных компонентов.

РАЗДЕЛ Ш. ВИТАМИНЫ

Дата добавления: 2015-07-13