Многоцветное окрашивание хромосом

Метод флюоресцентной гибридизации in situ

Молекулярная цитогенетика

Следующее революционное достижение молекулярной цитогенетики — метод флюоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence In Situ Hybridization — FISH), обеспечивший прямую связь между микроскопом и секвенированием. Эта техника позволяет увидеть хромосомную локализацию специфических последовательно­стей ДНК с помощью микроскопа. Прогрессивность методики — в замене радио­активного мечения проб ДНК и РНК, применяемого с 1969 г., на флюоресцентное. Флюоресцентные красители — мягкие и простые в употреблении, могут храниться неопределённо долго, дают высокое разрешение и позволяют одновременно иссле­довать несколько последовательностей ДНК.

Появление FISH расширило возможности картирования генома, в частности идентификацию малых хромосомных аномалий. Метод FISH используют для упо­рядочивания ДНК-клонов и идентификации точек разрыва, оценки построенных карт, идентификации повреждённых генов в больших коллекциях картированных сегментов генома человека.

Методика FISH легла в основу открытия импринтинга генов региона 15qll- 15ql3 (длинное плечо хромосомы 15) при синдромах Ангельмана и Прадера- Вилли.

В лабораториях клинической цитогенетики FISH используют с диагностической и исследовательской целью. В настоящее время созданы коммерческие наборы проб, пригодные для решения различных задач, например для диагностики син­дрома, обусловленного малой хромосомной аномалией, незаметной при обычном дифференциальном окрашивании. Исключительным примером является исполь­зование пробы для идентификации микроделеции хромосомы 17 при диагностике синдрома Смит-Магенис (необычное лицо, мышечная гипотония и задержка пси­хомоторного развития).

Что ещё более важно, FISH сделала доступными для цитогенетического анализа ядра неделящихся клеток. Хромосомы идентифицируют простым подсчётом сиг­налов в каждом ядре. Изменение числа сигналов свидетельствует о произошедшей делеции или амплификации (множественном копировании) гена. Так, дупликация длиной 1 Mb — причина синдрома Шарко-Мари-Туга— может быть определена интерфазной FISH. Позиционные сдвиги сигналов выявляют структурные пере­стройки, такие как транслокации и инверсии.

Последнее достижениее цитогенетических технологий — анализ многоцветно окрашенных хромосом. Новая методика, получившая название спектрального кариотипирования, или мультиплексной FISH (M-FISH), появилась в результате 3 новшеств. Во-первых, были созданы хромосом-специфические «краски»: кол­лекции последовательностей, выделенных из каждой хромосомы. Во-вторых, за счёт сочетания флюорохромов для каждой хромосомы получена своя 24-цветовая комбинация. В-третьих, для многоцветного анализа усовершенствована техника оптической микроскопии, системы фильтрации и отображения, позволяющие автоматически классифицировать каждый хромосомный сегмент.

M-FISH обладает высокой эффективностью выявления транслокаций и других сложных аберраций, например, репликации регионов llq, 21q и 22q при остром миелоидном лейкозе (OMJI). Метод M-FISH позволяет идентифицировать многие ранее неизвестные перестройки хромосом, особенно их концов (субтеломерные делеции), которые достаточно часто (7-10%) встречаются среди пациентов с интеллектуальным дефицитом.

Дата добавления: 2015-06-04