Цитогенетические методы

Переломным моментом в истории медицинской генетики стал 1956 г.: было обнаружено, что диплоидный набор составляет 46 хромосом (а не 48, как пред­полагали ранее). Это произошло спустя всего 3 после открытия двойной

структуры ДНК Уотсоном и Криком. Открытие было значительным для медицины, потому что развитие техники к тому моменту позволило выполнять хромосомный анализ для изучения заболевания и постановки диагноза. Медицинская генетика, которая до 1956 г. не считалась клинической дисциплиной, получила свой «пред­мет» для изучения — ядро клетки — такой же, как сердце в кардиологии и нервная система в неврологии.

Однако только правильное определение количества хромосом и развитие тех­ники позволило уже в 1959 г. Жерому Лежену (Jerome Lejeune) найти маленькую добавочную хромосому 21, отвечающую за монголизм (синдром Дауна). Позже были обнаружены другие аномалии количественного состава половых хромосом при синдромах Тернера и Клайнфелтера. В начале 1960-х аномалии количества и структуры хромосом были описаны при других врождённых патологических синдромах, таких как трисомии 13 и 18, разнообразные транслокации, делеции, мозаичность и триплоидии (в тканях спонтанных абортусов).

Возможность обнаруживать клетки с хромосомными аберрациями в амниоти- ческой жидкости позволила с 1966 г. проводить пренатальную диагностику син­дрома Дауна и других хромосомных заболеваний с помощью амниоцентеза.

К началу 70-х гг. различные методики дифференциальной окраски хромосом позволили увидеть их продольную исчерченность. Хорошо выраженный рисунок этих «полосок» (banding) даёт возможность идентифицировать каждую хромо­сому. Этот метод был применён для исследования клетки в определённой фазе деления, когда хромосомы раскручены, и тогда стало возможным выявлять малей­шие делеции и перестройки в структуре хромосом. Как стало ясно впоследствии, «полосатость» хромосом коррелирует с насыщенностью различными азотистыми основаниями молекулы ДНК, повторяющимися последовательностями ДНК, вре­менем репликации и плотностью упаковки хроматина.

Анализ корреляций кариотипа и фенотипа лёг в основу описания новых син­дромов, связанных с микроделециями хромосом, таких как синдром Вильямса (Online Mendelian Inheritance in Man — OMIM 104050) и родственных синдромов «протяжённого гена» (contiguous gene syndromes), таких как синдром Диджорджа (DiGeorge) (OMIM 188400).

Молекулярная генетика и проект «Геном человека»

В начале 80-х гг. XX в. молекулярная генетика подошла к картированию генов на хромосомах с помощью 3 методических приёмов:

• получения ДНК-зондов для анализа соматических гибридных клеток;

• использования ДНК-зондов (вначале радиоактивных, затем флюоресцент­ных) для in situ гибридизации на хромосомах; этот метод прямого картирова­ния был впервые применён на практике в 1981 г.;

• получения избыточного количества ДНК-маркёров, что может быть исполь­зовано для генетического сцепления в семейных случаях.

Первоначально такие исследования были серьёзно стеснены небольшим количе­ством маркёров. Сейчас ДНК-маркёры представлены полиморфными рестрикци- онными фрагментами, вариабельными тандемными повторами, микросателлита­ми или короткими тандемными повторами и полиморфными мононуклеотидами.

К 1985 г., когда начался проект «Геном человека» (Human Genome Project), была известна локализация примерно 700 генов. Это были гены, отвечающие за группы крови, некоторые ферменты, структурные белки и т.д. Часто во время картирования генов основа дефекта, то есть дефектный белок, была неизвестна. При объединении несистематизированных данных стала очевидной полезность карт генного картирования для клинической медицины. Изобилие ДНК-маркёров позволило найти клиническое применение этим данным. Первым заболеванием, картированным с помощью ДНК-маркёров, была хорея Гентингтона (1983), ген которой локализован на конце короткого плеча хромосомы 4. Клиническое при­менение такой информации очевидно. С помощью этого метода стало возможным проводить пренатальную и доклиническую диагностику.

Еще одна область применения генных карт для изучения дефектных генов — позиционное клонирование. Так, в 1993 г. с помощью позиционного клонирования был изолирован ген хореи Гентингтона. Выяснилось, что исследуемый регион достаточно примечателен, так как это локус для нового типа мутаций в виде вариа­бельных тринуклеотидных повторов.

Первые 4 успеха позиционного клонирования связаны со следующими забо­леваниями: хроническим гранулематозом и мышечной дистрофией Дюшенна в 1986 г.; ретинобластомой и муковисцидозом в 1989 г. Муковисцидоз был первым заболеванием, верифицированным путём позиционного клонирования без при­менения цитогенетического анализа.

Секвенирование генома человека (определение последовательности нуклеотидных оснований генома)

Большинство генов, картированных до проекта «Геном человека», были картированы формально. К тому же технические возможности клонирования для изоляции поражённого гена получили принципиальную основу только в 1986 г.

В 1953 г. Уотсон и Крик с помощью рентгеновской дифракции выявили, что ДНК представляет собой двойную спираль. Генетический код триплета нуклео- тида, специфичный для каждой нуклеиновой кислоты, был детально выяснен в 1966 г. В конце 60-х были открыты ограничительные ферменты, которые рассе­кали ДНК в определённых местах и таким образом могли служить скальпелем для рассечения генома. В начале 70-х было обнаружено, что гены (включая также гены человека) могут быть клонированы в избытке.

В 1977 г. Мэксам и Гилберт (Махат and Gilbert) и Сангер и соавт. (Sanger et al.) доложили об улучшении методики секвенирования ДНК. Метод Сангера стал краеугольным камнем проекта «Геном человека»: метод был модифицирован, автоматизирован и стал более эффективным, но до настоящего времени остался принципиально основным в этих исследованиях.

Геномы 5 добровольцев, представляющих 4 расовые группы обоих полов, были расшифрованы частной компанией (Cetera Genomic Inc.; основатель Дж. Крейг Вентер), работающей по принципу фабрики: ДНК и получение клонов, секвенирование и объединение с автоматизацией и компьютеризацией всех эта­пов. Общий объём и качество программы «Геном человека» поднялись на новый уровень в результате координации работ с различными лабораториями США, Великобритании, Японии, Франции, Германии и других стран под руководством Френсиса Коллинза (Francis Collins).

В Белом Доме 26 июня 2000 г. Коллинз и Вентер представили комплект первоначальных общественных и частных результатов секвенирования генома человека, которые были опубликованы в середине февраля 2001 г. Результаты общественного фонда опубликованы в журнале «Nature», а результаты Celera — в журнале Science.

Лучшее понимание индивидуальной конституции генома позволит изменить подход к лекарственной терапии и даст возможность выбирать лекарства, веро­ятно, более эффективные в лечении именно этого заболевания именно у этого пациента. Даже при специфической лекарственной терапии, предположительно эффективной при данном заболевании у данного пациента, генетическая кон­ституция может увеличивать риск неблагоприятных реакций. Идентифицировав такой риск во время подбора лечения для данного пациента, можно значительно снизить количество ятрогенных заболеваний и летальность.

Дата добавления: 2015-06-04